Мембранные белки кристаллизуются с большим трудом. Бывают основные части белка, например мембранные. Есть альфа-спирали, которые пронизывают мембрану. Представьте себе спиральный шнур для старого телефона. Если его сложить, то в том месте, в котором вы его складываете, у него будет очень большое напряжение, поэтому в этом месте он разовьется, перестанет быть шнуром и образует петлю. И точно так же происходит с белками: у них есть трансмембранный сегмент, за ним петля, потом следующий трансмембранный сегмент и снова петля.

Ученые начинают искать в окружающей среде природные мембраны, в которых очень много этих каналов. Например, есть электрический орган электрического ската, который напичкан ацетилхолиновыми рецепторами. Еще есть пурпурная мембрана, в которой так же расположены родопсины. Все это нативные биологические двумерные кристаллы.

В рентгеноструктурном анализе используются трехмерные кристаллы, то есть кристаллы белка, в которых белок представлен как некий кубик. Для мембранных белков была придумана двумерная кристаллография, начавшаяся с таких естественных мембран, в которых есть один слой мембранного белка, около которого находится небольшое количество липидов. При изучении природных двумерных кристаллов была получена структура ацетилхолинового рецептора. Ее разрешение было не очень высоким, но по крайней мере было видно, что есть мембранная, внемембранная и внутриклеточная части и родопсин. Родопсин — это ионный канал, который состоит из семи трансмембранных спиралей. Он маленький, у него есть только трансмембранная часть, а внеклеточная и внутриклеточная отсутствуют. Далее на этой пурпурной мембране пытались получить высокое разрешение.

Поскольку у вас есть большая мембрана, вы смотрите на нее как бы сверху. Электроны летят сверху в колонне от катода мимо анода и дальше вниз, где они встречаются с образцом. Если мембрана плоская, то вы видите проекционную структуру того, что у вас там находится. У вас есть альфа-спирали, которые натыканы в мембрану, и вы видите их проекцию в виде кружочков. Чтобы получить трехмерную структуру, надо повернуть всю мембрану на какой-то угол, иначе вы не сможете посмотреть на нее сбоку. В результате этого удалось рассмотреть какие-то проекционные структуры, но негативное контрастирование существенно ограничивает разрешение — лучше 8–10 ангстрем (размер гранул солей тяжелых металлов) получить не удается. Это подтолкнуло другую лабораторию под руководством Дюбаше к тому, чтобы придумать, как же можно изучать неокрашенные образцы.

Зачем нужно окрашивание? Электроны летят с большой скоростью и имеют энергию. Когда они сталкиваются с образцом, они могут упруго отскочить, а могут отдать часть энергии образцу. А когда образец получает эту энергию, в нем начинаются всевозможные радиационные поражения, которые все закрывают. С тяжелыми металлами все не так плохо, но неокрашенный образец засыхает. Если вы положите белок на подложку и уберете воду, он засохнет. Поэтому придумали взять воду или буфер с образцом и получить из него очень тонкий слой. В электронный микроскоп мы помещаем образец, который представляет собой тонкий, меньше чем полмикрона, слой буфера, в котором располагаются отдельные молекулы. С ним взаимодействует пускаемый нами пучок электронов, и мы получаем соответствующую картинку того, что мы туда поместили.

Но если просто пустить пучок электронов в лед, то он растает. Поэтому придумали так называемый режим низкой дозы. Как вообще происходит съемка в электронном микроскопе? Вы нашли какое-то место, которое хотите снять с большим увеличением. Для начала вы находите его с низким увеличением, на котором не должно быть никакого особенного электронного повреждения, потому что с низким увеличением энергия этого пучка получается слишком низкой. После этого вы находите это место и переключаетесь на режим фокусировки. Но фокусировка происходит не над тем местом, которое вы фотографируете с высоким увеличением, а на определенном расстоянии от него. После фокусировки вы переходите на интересующую вас область буквально на одну секунду, делаете снимок и снова возвращаетесь обратно. Естественно, в современных микроскопах это все сделано автоматически: в компьютере вы переходите между тремя режимами, выравненными относительно друг друга.

Рекомендуем по этой теме:
3073
Белки в свете рентгеновских лучей

Изначально микроскопы фотографировали на пленку. Вы не могли ничего увидеть, пока все не снимете. Эта процедура была очень длительной: фотографии нужно было проявить, промыть, высушить, и только потом вы узнавали, есть ли результат, обнаружен ли белок, потому что его просто может не быть. Получается, что результат того, что вы делаете, отложен.

Сначала придумали CCD-камеру (ПЗС-камеру, если по-русски), прибор с зарядовой связью, — это та камера, которая у всех сейчас в фотоаппаратах и телефонах. Начав фотографировать на CCD-камеры, все поняли, как это хорошо, потому что вы сразу можете увидеть, есть у вас белок или нет. С развитием технических новшеств работа ученых упрощалась. В 2010-х годах люди начали получать субнанометровое разрешение (2,5–3,5 ангстрема) — результаты электронной микроскопии практически сравнялись с результатами кристаллографическими. Теперь можно изучать крупные молекулы, ионные каналы, которые всегда были мечтой ученых, и видеть, как взаимодействуют различные домены и спирали друг с другом. Это все стало возможным из-за того, что придумали новый тип детектора, который очень сильно улучшил разрешение.

Результаты структурной биологии очень сильно связаны со всевозможными технологическими прорывами. Например, научиться чистить ионные каналы белков так, чтобы они оставались при этом функциональными, — это некая сложность, которую нужно преодолеть. Как проверить, функционален ли белок в очищенном состоянии, — это тоже открытый вопрос.

Сейчас электронные микроскопы почти сравнялись в разрешении с рентгеноструктурным анализом, и, видимо, нужно будет придумывать что-то еще. Технологии всегда продолжительно развиваются, поднимаются на некую высоту, после чего они становятся рутинными. Если у вас есть деньги, вы купите хороший микроскоп с хорошим компьютером и через некоторое время сможете получать очень хорошие данные и проводить расчеты. В таких условиях биохимики снова начинают играть главную роль в структурной биологии. Чтобы получить хорошую структуру, вам нужно иметь изначально почищенный белок, а все остальное приложится, так как технические возможности открыты.