Структурная биология
Когда я начал работать в этой области, я был структурным биологом, мои интересы лежали в соответствующей области. В 1970-х годах о мембранных белках было известно очень мало, и именно тогда у меня возник интерес к этой области. Мы начали изучать этот вопрос; были работы, например, Гортера и Гренделя, модели Сингера — Николсона, но они были довольно общими. Наша же идея состояла в том, чтобы сосредоточиться на конкретном мембранном белке (а их существуют тысячи), выяснить, как работает этот белок, а затем перейти к следующему, чтобы в итоге получить общую картину того, какова структура всех мембранных белков.
Функционирование мембранных белков — это ключ к пониманию того, как мембрана взаимодействует с внешним миром. Структурные биологи — а я отношусь именно к ним — полагают, что, если вы видите структуру чего-то, вы можете просто посмотреть и догадаться, как это работает, что в каком-то смысле очевидно. Похожим образом вы можете посмотреть на проезжающую мимо машину с четырьмя круглыми колесами и, просто глядя на нее, в общих чертах понять, как она работает. Так что философия структурных биологов такова: нужно найти структуру, чтобы прийти к определенным выводам или догадкам или по крайней мере выдвинуть одну-две гипотезы, которые в дальнейшем можно будет проверить. Таким образом, как нам кажется, структура даст нам понимание мембранных белков, а они — понимание самих мембран.
Ранние исследования мембранных белков
Когда я начинал работу в этой области, о мембранных белках толком ничего не было известно, но были немембранные белковые структуры вроде энзимов или гемоглобина, переносчика кислорода в крови. Два структурных элемента, характерные для всех белков, были выделены Лайнусом Полингом, который получил Нобелевскую премию за эту и другие работы, связанные со структурой молекул. В 1950-х годах Полинг и Кори создали модель, которая позволила им предположить (тогда это еще не было доказано), что у всех белков есть вторичная структура: полипептидная цепочка — цепочка аминокислот, составляющая белок, — должна быть определенным образом уложена в трех измерениях. Были выдвинуты две гипотезы, обе из которых оказались верными: есть так называемая альфа-спираль — спиральная организация полипептидной цепочки, в которой на каждый оборот цепочки приходится 3,6 аминокислотного остатка, — и бета-структура, в которой цепочка полностью вытянута, то есть располагается не по спирали, а следующая линия укладывается либо встречно-параллельно, либо параллельно первой.
Вскоре после этого при помощи рентгеноструктурного анализа была установлена структура миоглобина, и было показано, что он состоит полностью из альфа-спиралей Полинга с гем-группой (красный пигмент, связывающий кислород) посередине. Чуть позже были открыты другие структуры: лизоцим, химотрипсин. Теперь в банке данных белков собраны сотни тысяч наборов координат с десятками тысяч различных структур белков, и во всех есть альфа-спирали и бета-листы. Мембранные белки в 1970-х не были известны, и многие гадали, какими они будут.
В мембранах есть липидный бислой — гидрофобный барьер между клеткой и окружающим миром. Молекулы белка должны либо располагаться на липидах, либо проходить сквозь мембрану — это трансмембранные белки. Появилась идея о том, что те части белка, которые должны взаимодействовать с водой, не могут взаимодействовать с липидным бислоем. В молекуле белка есть полипептидная цепочка, и некоторые ее компоненты должны быть растворимы в воде. Итак, есть пептидная связь, есть NH-группа, и есть карбонильная группа, то есть мы имеем пептидную связь и NH—CO, и это два компонента, связанные с альфа-спиралями и бета-листами Полинга. В бета-листах все водородные связи должны быть убраны внутрь листа, а в альфа-спирали водородные связи между NH и CO оказываются внутри нее, так что это разумная гипотеза.
На конференции в Альпах в 1980 году мы заявили: все мембранные белки либо будут состоять из пучка полипептидных альфа-спиралей, пронизывающих липидный бислой один или несколько раз, либо в них будет бета-структура. Для нее единственный способ убрать все водородные связи — сделать бета-бочонок. Например, химотрипсин — это растворимый энзим, состоящий из шести бета-тяжей, образующих два бета-бочонка.
Итак, гипотеза была такова, что мембранные белки будут состоять либо из альфа-спиралей, либо из бета-бочонков. Теперь у нас есть структура тысяч мембранных белков, и почти все они состоят либо из трансмембранных пучков альфа-спиралей, либо из бета-бочонков. Время от времени попадается бета-бочонок с одной альфа-спиралью, проходящей посередине, или бета-бочонок со спиралями снаружи. В целом идея о том, что мембранные белки — это либо трансмембранные спирали, либо трансмембранные бета-бочонки, оказалась верной. Большая часть мембранных белков на внешних мембранах бактерий, в митохондриях и хлоропластах обладает структурой бета-бочонков, а большая часть мембранных белков на внутренних мембранах — ядерной мембране, эндоплазматической сети, рибосомах — состоит из пучков альфа-спиралей.
Таким образом, у нас есть общее представление о том, что следует ожидать в разных мембранах разных органелл, и оно соответствует фундаментальной теории о спиралях и бета-листах Полинга и о том, как они встроены в мембраны. Со временем мы собрали больше данных о конкретных белках — обычно они приходили от одного ученого или группы ученых, занимавшихся конкретными мембранными белками.
Исследования бактериородопсина и реакционных центров
Когда я был молодым ученым, мы решили, что самыми интересные белки в мембранах могут быть у людей, например, ионные каналы. Нервные клетки проводят импульс от одного конца к другому, и механизм их работы был установлен Ходжкином и Хаксли, когда они анализировали потоки ионов натрия и калия, идущие в мембраны и наружу. Они не знали, что это было, но сказали: когда нервный импульс проходит по нерву или в мышцы, сначала открываются каналы, проницаемые для ионов натрия, и они изнутри клетки выходят наружу. Заряд клетки падает с -60 или -70 мВ до нуля, а это открывает другие каналы, и распространяется нервный импульс. Восстановление происходит, когда закрываются натриевые каналы и открываются калиевые: ионы возвращаются обратно, и мембрана возвращается к потенциалу покоя.
Эти мембранные белки были и остаются крайне важными, и над ними по-прежнему ведется работа, но в 1970-х заниматься ими было крайне сложно. Поэтому мы решили поискать более простые, стабильные мембранные белки, с которыми было бы проще работать. Я на 10–15 лет сосредоточился на бактериородопсине, который оказался мембранным белком с семью трансмембранными спиралями — такой пучок альфа-спиралей, который соотносится с теорий Полинга. Мы обнаружили его структуру сперва на низком разрешении в 1975 году, а затем на высоком разрешении в 1990 году.
Еще один мембранный белок, который очень сильно повилял на исследования в самом начале, был описан в работе Хартмута Михеля, исследователя Института биохимии Общества Макса Планка, расположенного в Мартинсриде, Германии. Он сосредоточился на реакционных центрах — это место, куда отправляется энергия света после попадания в хлоропласты и где она превращается в ионный градиент, распространяющийся по мембране. Он определил эту кристаллическую структуру, состоящую из четырех белков, в 1983 году, она была невероятно красивой. Он и Иоганн Дайзенхофер расшифровали эту структуру и опубликовали ее в 1985 году и в дальнейших работах. Она тоже состояла из одиннадцати трансмембранных спиралей, так что субъединицы L и M каждая состояли из пяти спиралей, окружающих хлорофилл, связанный с захватом света, и еще одной трансмембранной спирали.
Итак, в бактериородопсине семь трансмембранных спиралей, в реакционных центрах — одиннадцать, и это очертило поле работы в середине 1980-х. Вскоре после этого Майкл Гаравито, который работал с Юргом Розенбушем в Швейцарии, определил первую структуру белка внешней мембраны бактерии, которая, как оказалось, состояла из шестнадцати тяжей бета-бочонков. Так что к 1990–1991 годам у нас было два-три примера мембранных белков, которые были либо трансмембранными пучками альфа-спиралей, либо бета-бочонками, которые, таким образом, дали нам больше деталей в общей картине, обрисованной ранними теориями.
Современные методы изучения белков
На протяжении 1990–2000-х методы улучшались. Некоторые структуры были открыты посредством электронной криомикроскопией, которая изначально была нашей областью интересов, другие были определены при помощи создания 3D-кристаллов и проведения рентгеноструктурного кристаллографического анализа. Появились и другие мощные методы, например липидная кубическая фаза — особый способ кристаллизовать мембранные белки в трех измерениях, благодаря которому были обнаружены многие структуры. В последнее время метод электронной криомикроскопии был улучшен при помощи нового технологического оснащения — микроскопов и детекторов, и теперь вы можете определить структуры мембранных и других белков без создания кристалла, без проведения электронной кристаллографии или рентгеноструктурного кристаллографического анализа. И сейчас становится все больше очень важных структур мембранных белков, которые были определены этими методами.
Теперь у нас есть банк данных — депозитарий, в котором хранятся структуры белков, нуклеиновых кислот, рибонуклеопротеинов — самых разных белков и BAR-доменов (сейчас их хранится сотни тысяч). Даже просто просмотреть их все займет большое количество времени. Из них несколько тысяч — это структуры мембранных белков, так что у нас есть представление о трехмерных структурах примерно половины белков в мире — либо как 3D-изображение самой структуры, либо как связанная, тождественная структура.
Подводя итоги, можно заметить, что, начав с нуля, мы пришли к пониманию структур тысяч разных мембранных белков с бета-бочонками, альфа-спиралями или их гибридами. Есть также особые, редкие мембранные белки, например аквапорин, который позволяет молекулам воды проходить во все клетки, но в особенности в красные кровяные тельца, и контролирует их размер и осмотическое давление. В нем особенная организация полипептидной цепочки, где одна цепочка заходит в мембрану, разворачивается на полпути и выходит обратно, а с другой стороны происходит то же самое. Так что есть небольшое количество особенных мембранных белков, которые не попадают в эти категории, так как у них очень специфическая функция. Я бы сказал, сейчас у нас есть хорошее представление о структуре мембранных белков, и это знание является неотъемлемой частью мышления всех биологов, которые занимаются самыми разными аспектами этой науки.
Это перевод материала нашего англоязычного издания Serious Science. Послушать оригинальную версию лекции нобелевского лауреата Ричарда Хендерсона можно по ссылке. За перевод благодарим Ирину Линеву.
