В начале 2013 года несколько групп ученых показали, что системы CRISPR/Cas могут работать не только в клетках бактерий, но и в клетках высших организмов, а значит, CRISPR/Cas-системы дают возможность исправлять неправильные последовательности генов и таким образом лечить наследственные заболевания человека.
Открытие иммунной системы бактерий
Никто не мог предположить, что практическая возможность лечить генетические болезни человека появится «благодаря» бактериям. В конце 80-х годов японские ученые частично секвенировали геном кишечной палочки и нашли интересный участок, который ничего не кодировал. Этот участок содержал повторяющиеся последовательности ДНК, разделенные вариабельными участками — спейсерами. Наличие протяженного некодирующего участка удивило японцев, так как бактерии экономно относятся к своей ДНК и обычно не несут лишних последовательностей. Позже подобные «кассеты» повторов и спейсеров найдут у большого количества бактерий и архей и назовут CRISPR.
Для бактерий одного вида характерно наличие многочисленных штаммов, которые часто сильно отличаются друг от друга. В некотором смысле штаммы можно рассматривать как аналог рас или пород животных. Один штамм одного и того же вида бактерии может быть совершенно безобидным, а другой — опасным патогеном. У разных штаммов бактерий обнаружилась вариабельность, или полиморфизм, по наличию, отсутствию или порядку спейсеров в CRISPR-кассетах. Это свойство, значение которого было совершенно неизвестно, стало широко использоваться для типирования штаммов и эпидемиологического анализа. В частности, компания Danisco, занимающаяся производством заквасок для молочной промышленности, стала использовать это свойство для классификации своих коммерческих штаммов. Это было удобно и из патентных соображений, ведь несанкционированное использование типированных штаммов Danisco можно было легко выявить и засудить нарушителей.
В начале 2000-х годов несколько ученых независимо друг от друга сравнили последовательности известных CRISPR-спейсеров с последовательностями ДНК, депонированными в публичные базы данных. Оказалось, что довольно часто последовательности спейсеров были похожи на последовательности вирусов. Это позволило предположить, что CRISPR-кассеты могут нести защитную функцию. Результаты были опубликованы в журналах, находящихся в нижней части научной «табели о рангах», и в общем мало кого заинтересовали. Тогда же были обнаружены Cas-гены, часто расположенные рядом с CRISPR-кассетами. Группа биоинформатика Евгения Кунина предложила довольно детальную гипотетическую схему механизма действия CRISPR/Cas-систем. Согласно их модели, при попадании вируса в клетку он обнаруживается с помощью белка Cas, использующего синтезированную c CRISPR РНК-копию. Если какой-либо фрагмент генома вируса совпал с записанным в спейсере, Cas разрезает вирусную ДНК и запускает цепь реакций, в результате вся ДНК уничтожается.
При промышленном производстве кисломолочных продуктов вирусы-бактериофаги, случайно попадающие в ферментеры (огромные чаны с молоком и внесенными туда молочнокислыми бактериями), нарушают ферментацию, что приводит к огромным убыткам. Для того чтобы этого избежать, нужно использовать устойчивые к вирусам бактерии. Вывести такие бактерии просто: достаточно в лабораторных условиях отобрать клоны бактерий, способные к росту в присутствии вируса. Эту процедуру и провели в компании Danisco, но при выборке заметили одну важную особенность. Оказалось, что в CRISPR-кассетах клонов, ставших устойчивыми к вирусу, появлялись новые спейсеры, соответствовавшие участкам вирусного генома. Тогда ученые провели прямой эксперимент и методами молекулярной генетики вставили спейсер с последовательностью ДНК вируса в CRISPR-кассету бактерии. И такая генно-модифицированная бактерия действительно оказалась устойчивой к вирусу. Эти результаты были опубликованы в журнале Science в 2007 году и были первым экспериментальным подтверждением защитного действия CRISPR/Cas-систем, опосредованного последовательностями спейсеров. Немногим позже в Science была опубликована статья группой Джона ван дер Ооста (prof. dr. John van der Oost) «CRISPR-Cas Systems: RNA-mediated Adaptive Immunity in Bacteria and Archaea», в которой показывалось, что система действительно работает через малые CRISPR РНК. Статья была выпущена в соавторстве с группой Кунина.
Разработка технологии CRISPR/Cas9
Исходные системы, предсказанные в группе Кунина и другими учеными, кодировали большое количество Cas-белков, необходимых для бактериальной защиты. Но также был обнаружен класс систем, которые кодировали только один Cas-белок, правда очень большой. Защитное действие таких систем было продемонстрировано французской исследовательницей Эммануэль Шарпентье. Если в стандартных системах несколько белков собираются в сложный комплекс, связывающий CRISPR РНК, а затем этот комплекс узнает вирусную ДНК-мишень и привлекает еще один белок, «кусающий» вирусную ДНК, то в системе, которую повезло изучать Шарпентье, один белок, получивший название Cas9, выполняет все эти функции: и связывает CRISPR РНК, и узнает мишень, и «раскусывает» ее.
В 2012 году группы Шарпентье и Дженнифер Дудны из Университета Беркли опубликовали совместную статью в Science, где предложили способ перепрограммирования системы CRISPR/Cas таким образом, чтобы она стала направленно разрезать ДНК в участках, целенаправленно выбранных исследователем. В природе CRISPR РНК кодируется в CRISPR-кассете, связывается белками и потом узнает мишень. Оказалось, что можно получать неприродную CRISPR РНК с помощью химического или ферментативного синтеза. При этом место спейсера в такой РНК занимает последовательность, выбранная исследователем. Белок Cas9 способен «узнать» и связаться с такой синтетической СRISPR РНК (ее называют «гид») и становится запрограммированным на узнавание и разрезание соответствующего ей места в ДНК. Группы Шарпентье и Дудны продемонстрировали возможность такого подхода in vitro, то есть в пробирке.
Практически в это же время группы Джорджа Черча и его бывшего аспиранта Фенга Жанга (Feng Zhang) из Института Броуда в MIT показали, что бактериальный белок Cas9 и гид РНК способны «работать», узнавать и направленно разрезать ДНК в клетках высших организмов, в частности человека. MIT успел подать заявку на патент на день раньше, чем Беркли. С тех пор между двумя университетами начались патентные войны, которые продолжаются до сих пор.
Механизм геномного редактирования с помощью CRISPR/Cas9
Мы диплоиды. Это значит, что у нас двойной набор хромосом — по одному от папы и мамы. Если одна из родительских хромосом «неправильная», то есть в ней изменена последовательность ДНК в каком-то важном гене, может возникнуть состояние носительства генетической болезни, а если обе копии неправильные — возникнет генетическая болезнь. Классический пример — гемофилия у царевича Алексея Романова. Его бабка Виктория передала ему неправильную копию гена на X-хромосоме, хотя сама от гемофилии не страдала, потому что у нее две X-хромосомы и вместо дефектной работала здоровая хромосома. А Алексею не повезло, ведь у него только одна Х-хромосома.
Для того чтобы вылечить генетическую болезнь, нужно исправить генетическую информацию, затронутую мутацией. Гемофилия, как и большинство генетических болезней, вызвана изменением только одной буквы ДНК, а всего в нашем геноме 6 миллиардов букв. Это тысячи книг размером с «Войну и мир». Мы должны найти только одну «опечатку» и исправить ее в заданном месте, не изменив ничего больше. Это и есть задача геномной медицины.
Чтобы исправить «неправильный» ген, нам нужен очень точный молекулярный «скальпель», который найдет мутантную последовательность нуклеотидов и сможет «вырезать» ее из ДНК. Таким «скальпелем» и является Cas9. С помощью гида РНК, последовательность которой совпадает с искомым местом, он может внести разрыв в нужное место генома. Узнавание мишени происходит на участке длиной в 20–30 нуклеотидов. В среднем последовательности такой длины встречаются в геноме человека единожды, что позволяет обеспечить точность. Клетка не умрет от внесения разрыва в ДНК, так как он будет исправлен по здоровой копии из парной хромосомы за счет естественного процесса репарации ДНК. Если парной хромосомы нет, как в случае гемофилии, можно внести в клетку участок «правильного» гена одновременно с Cas9 и РНК-гидом и использовать его как матрицу для залечивания внесенного разрыва.
С помощью CRISPR/Cas9 можно делать мультиплексное редактирование сразу нескольких неправильных генов. Для этого достаточно ввести белок Cas9 и несколько разных РНК-гидов. Каждый из них направит Cas9 к собственной мишени, и вместе они устранят генетическую проблему.
В целом описанный механизм функционирует за счет принципа комплементарности, который впервые был предложен Джимом Уотсоном и Френсисом Криком в их знаменитой модели двуцепочечной ДНК. Цепочки двойной спирали ДНК «узнают» друг друга по правилам комплементарности. CRISPR РНК узнает свои мишени в двуцепочечной ДНК таким же образом, при этом образуется необычная структура, содержащая двуцепочечный участок взаимокомплементарных РНК и одной из цепей ДНК-мишени, а другая цепь ДНК оказывается «вытесненной».
Системы ZFNs и TALENs
Параллельно с системой CRISPR/Cas9 развивались и другие подходы к редактированию генома, а именно с помощью TALEN-белков и белков с так называемыми цинковыми пальцами. Это генно-инженерные белки, которые могут «кусать» ДНК. Ученые пытались научить их узнавать специфическую, в идеале — любую заданную последовательность ДНК. Иногда это работало, но для каждой последовательности приходилось создавать свой отдельный белок, а это кропотливая и долгая работа. Для редактирования же генома с помощью системы CRISPR/Cas9 используется единственный белок, а РНК-гид можно создать за короткое время в любой приличной лаборатории или просто купить. Это совершенно новый уровень редактирования, дешевый и точный. Его основное преимущество в том, что он основан на простом принципе комплементарного узнавания, который используется для узнавания последовательности одних нуклеиновых кислот с помощью других, комплементарных нуклеиновых кислот.
CRISPR/Cas9 в лечении наследственных заболеваний
В первую очередь с помощью CRISPR/Cas9 мы сможем лечить «простые», моногенные генетические заболевания: гемофилию, муковисцидоз, лейкемию. В этих случаях понятно, что именно нужно отредактировать, но существуют заболевания с высокой наследуемостью, генетическая природа которых очень сложна. Такие болезни — сложный результат взаимодействия разных генов и их вариантов. Например, многие ученые ищут гены шизофрении и алкоголизма, каждый год находят новые, каждый год часть ранее отрытых генов оказывается ни при чем. Как лечить такие сложные болезни с помощью CRISPR/Cas9 — непонятно, и, очевидно, потребуются мультиплексные подходы.
Надо понимать, что практическое применение CRISPR/Cas9 в медицине — это скорее отдаленное будущее, потребуется еще масса работы, улучшения технологии, ее надежности и безопасности. В целом ситуация с болезнями крови лучше, так как испорченный ген нужен только для кроветворения, а технологии клеточной терапии для таких болезней хорошо отработаны. Предположим, человек болеет лейкемией. Сейчас, для того чтобы устранить болезнь, его облучат, найдут подходящего донора и пересадят костный мозг. Донора искать долго, а полного иммунологического соответствия никогда не бывает.
Используя систему CRISPR/Cas9, мы могли бы получить образец костного мозга пациента и вылечить его собственные кроветворные стволовые клетки, изменив неправильную букву. Затем пациента придется облучить, чтобы убить пораженные кроветворные клетки, и ввести его же собственные отредактированные клетки обратно — не клетки ближайшего родственника или вообще незнакомого человека, а именно его, полностью совместимые. Они начнут делиться и производить здоровые кровяные клетки. Если же речь идет о редактировании, например, опухоли печени, все гораздо сложнее. Нужно будет решить главную медицинскую проблему — проблему доставки компонентов CRISPR/Cas9-системы именно к пораженным клеткам.
Эксперимент с человеческими эмбрионами
В 2015 году китайские ученые предприняли попытку исправить геном человеческого эмбриона. Они взяли оплодотворенную человеческую яйцеклетку с испорченным геном, приводящим к болезни крови бета-талассемии. В клетку были введены белок Cas9 и РНК-гид, которые должны были найти и «раскусить» неправильную копию гена с последующей репарацией по здоровой матрице. В результате эксперимента в 5–10% эмбрионов мутация, ответственная за возникновение болезни у взрослых людей, действительно была исправлена. Это хорошая новость.
Плохая новость заключалась в том, что во всех клетках пролеченных эмбрионов присутствовало большое количество мутаций, которые появились вовсе не там, где предполагалось. Таким образом, технология нуждается в совершенствовании, она недостаточно точная. Точное редактирование получается, когда участок ДНК-мишени длиной чуть больше 20 нуклеотидов комплементарно взаимодействует с полностью соответствующим ему РНК-гидом. Но ведь в геноме может существовать большое количество вариантов последовательности-мишени, отличающихся от нее лишь на одну букву, еще больше вариантов, отличающихся на две, и так далее. Каждая из таких вариантных мишеней взаимодействует хуже, чем идеально подходящая мишень, допустим в 10 раз хуже. Но так как таких последовательностей много, неправильного узнавания (а следовательно, разрезания и редактирования) избежать очень трудно. Как с этим быть, пока неясно. Очевидно, нужно улучшать специфичность белка Cas9 и очень тщательно выбирать гиды.
Перспективы изучения CRISPR-систем
Сегодня CRISPR — одна из самых востребованных технологий. Многие молодые люди, студенты, грезят о работе с CRISPRами. Но сейчас эти исследования становятся в общем технологическими. Фундаментальных вопросов осталось немного. В мире есть несколько устоявшихся сильных групп, конкуренция очень сильна. Перспективнее заняться тем, что через 5–10 лет могло бы выстрелить, повторить успех CRISPR/Cas. Но где будет следующий прорыв, предсказать нельзя, в этом и состоит прелесть науки, и это то, что делает бессмысленным всяческие форсайты и приводит в неистовство различных научных предсказателей-«экспертов». Интересно, что эта пока еще неизвестная область будущего прорыва вовсе не должна быть сейчас в мейнстриме, быть «важной». Ведь еще 10 лет назад никто из «серьезных» ученых CRISPRами не занимался. Кстати, CRISPR/Cas — это уже второй случай того, как работы по изучению взаимодействия бактерий и их вирусов приводят к революции в биомедицине. Первая революция произошла в 1970-х годах, когда были открыты ферменты рестрикции, без которых невозможно молекулярное клонирование и генная инженерия.
Среди имеющихся нерешенных проблем по биологии CRISPR/Cas-систем можно выделить следующие. Мы не знаем, откуда берется большинство спейсеров. Ведь только несколько процентов спейсеров имеют вирусное происхождение, похожи на участки ДНК известных вирусов, все остальные, подавляющее большинство, не похожи ни на что. Интересен вопрос эволюционного происхождения СRISPR/Cas-систем. Кунин предложил гипотезу, что они родственны транспозонам — участкам ДНК, которые кодируют специальные белки, занятые перестановкой тех самых участков ДНК, которые их кодируют. Такие необычные прыгающие гены. Сейчас эту гипотезу стараются подтвердить экспериментально. Кроме того, вполне актуален поиск новых, еще неизвестных CRISPR/Cas-систем. До недавнего времени было известно три разных типа, один из которых, тип II, оказался пригодным для редактирования. Недавно наша лаборатория в Сколтехе и Ратгерсе в сотрудничестве с группами Кунина и Жанга предсказала и экспериментально подтвердила наличие трех дополнительных типов этих систем, то есть мы не знаем всего их разнообразия. А среди неизвестных систем могут быть и такие, которые перспективны с практической точки зрения и свободны от недостатков систем на основе Cas9.
Другая интересная цель исследований, имеющая и очевидный практический интерес, — понять молекулярный механизм узнавания мишени и научиться контролировать этот процесс. Это частный случай общей проблемы специфического взаимодействия макромолекул. Ученые не очень хорошо понимают, как в клетке молекулы белков, нуклеиновых кислот находят своих «правильных» партнеров и избегают «неправильных» взаимодействий.
