Мы продолжаем наш ежегодный обзор результатов старейшей и наиболее важной международной награды за выдающиеся научные исследования — Нобелевской премии. По традиции обладателей премии объявляет Нобелевский комитет Королевской шведской академии наук в Стокгольме.

Все две недели мы будем следить за решениями Нобелевского комитета и публиковать комментарии наших авторов о лауреатах премии 2014 года и их вкладе в мировую науку. Следите за обновлениями!

Химия

Нобелевская премия по химии 2014 года присуждена Эрику Бетцигу (США), Уильяму Мернеру (США) и Штефану Хеллю (Германия) за развитие флуоресцентной микроскопии со сверхвысоким разрешением.

vorobjev

Иван Воробьев

доктор биологических наук, руководитель лаборатории клеточной подвижности НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского МГУ, профессор кафедры клеточной биологии и гистологии биологического факультета МГУ

Нобелевская премия по химии присуждена за разработку методов флуоресцентной микроскопии с разрешением, превышающим дифракционный предел. Говоря обыденным языком, за микроскопию сверхразрешения. Эти методы получили широкое распространение начиная с 2008 года, когда микроскопия сверхвысокого разрешения была признана «методом года» в специальном выпуске журнала Nature Methods.

Объективности ради следует сказать, что вклад трех лауреатов в разработку микроскопии суперразрешения далеко не одинаков. Штефан Хелл (Stephan Hell) обосновал, разработал и довел до практического воплощения один из трех основных современных методов — STED (STimulated Emission Depletion microscopy) — стимулируемое с помощью комбинации лазерных пучков возбуждение микрозоны препарата, которое позволяет сканировать образец со значительно меньшим шагом, чем в обычной микроскопии.

Из двух других методов суперразрешения PALM (PhotoActivated Localization Microscopy) также удостоился Нобелевской премии (Эрик Бетциг), но разрабатывали его, в отличие от STED, независимо несколько групп, а метод STORM (STochastic Optical Reconstruction Microscopy), созданный в лаборатории Ксяовея Жуанга (Xiaowei Zhuang, Гарвардский университет), награды не удостоился.

Для микроскопии все началось в 1994 году, когда Штефан Хелл опубликовал статью с изложением метода стимулирования истощения флуоресценции (STED). В этом методе лазерный импульс возбуждает все флуоресцентные молекулы внутри пятна, ограниченного дифракционным пределом (диаметром около 0,25 мкм), в то время как другой лазерный импульс гасит флуоресценцию от всех молекул, кроме тех, которые находятся в самом центре возбужденного пятна, в объеме нескольких десятков нанометров. Только эти молекулы затем регистрируются детектором. Перемещая такой миниатюрный зонд вдоль образца и последовательно измеряя уровень освещенности, можно получить полную картину препарата. Чем меньше объем, в котором молекулам позволено флуоресцировать в каждом положении зонда, тем выше разрешение конечного изображения. Следовательно, в принципе, дифракционный предел может быть преодолен. На практике достигнутый предел разрешения, достигнутый методом STED, составляет около 40 нм. На основе данного метода уже выпускаются серийно производимые микроскопы (фирма Leitz, Германия).

Рекомендуем по этой теме:
4092
Современный световой микроскоп

Работы Уильяма Мернера микроскопистам известны значительно меньше. Приоритет Мернера состоит в том, что он первым опубликовал работу, где оптическими средствами была идентифицирована отдельная молекула (1989 год), а затем, работая в лаборатории будущего Нобелевского лауреата Чена (L.B. Tsien) в Калифорнии, в 1997 году описал явление управляемого мерцания флуоресценции у молекулы зеленого флуоресцентного белка (GFP). В дальнейшем, используя подобные «мерцающие» молекулы флуорохромов, в 2006 году было достигнуто суперразрешение в методе STORM.

Третий лауреат, Эрик Бетциг, сначала работал с так называемой микроскопией ближнего поля. В данном методе крошечный зонд механически перемещается вдоль препарата, находясь от него на расстоянии всего несколько нанометров, и может регистрировать флуоресценцию от очень маленького объема. Однако поняв, что перспективы данного метода невелики — работать можно только с поверхностью образца, — Бетциг описал свои теоретические воззрения о том, как из флуоресценции отдельных молекул можно сложить картину с высоким разрешением (1995 год), и забросил исследования. Позднее, вдохновленный результатами Мернера и других авторов, наблюдавших флуоресценцию отдельных молекул с помощью обычной микроскопии, Эрик Бетциг, вернувшись из промышленности в академическую науку, пришел в лабораторию Липпинкотт-Шварц. Работая в ее лаборатории, он показал, что если последовательно возбуждать под микроскопом малую часть (около 0,1%) флуоресцирующих молекул в препарате, то расстояние между ними будет достаточно велико и позволит точно вычислить положение каждой из них. Затем, повторив процедуру случайного возбуждения тысячи раз и накладывая друг на друга множество получившихся изображений, можно получить полную картину препарата с разрешением, которое определяется только точностью локализации каждой молекулы. Таким образом (опубликовано в журнале Science, 2006), были получены изображения лизосом точностью значительно большей дифракционного предела.

Таким образом, современная микроскопия постепенно поднимается на новый уровень — наблюдение нанообъектов стало реальностью, а магический предел разрешающей способности микроскопа (предел Аббе, разрешение в четверть микрона) действительно оказался преодолимым, и достигаемое теперь разрешение составляет 10–20 нм, что лучше в 10–20 раз. Не следует думать, что эти работы уже произвели какой-то переворот в науке, пока, по сути дела, продемонстрированы только потенциальные возможности методов, а сами методы являются чрезвычайно трудоемкими, но, несомненно, они стимулируют новые поколения исследователей, которые понимают, что оптическая микроскопия еще далеко не исчерпала своих возможностей.

lukyanov

Константин Лукьянов

доктор биологических наук, заведующий лаборатории биофотоники Института биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН

Наиболее известным и широко обсуждаемым среди лауреатов премии является Штефан Хелл, из Германии. Еще в конце 90-х он придумал метод получения сверхвысокого разрешения STED — STimulated Emission Depletion microscopy. Но также после того, как Эрик Бетциг изобрел метод, основанный на другом явлении — на детекции единичных молекул и их картировании, — он внес в это направление много методических улучшений. Уильям Мернер первым визуализировал единичные молекулы флуорофора. На тот момент это был прорыв, а сейчас это более-менее широко используемая технология.

Обычная флуоресцентная микроскопия имеет довольно низкое разрешение. Это определяется тем, что свет дифрагирует и, согласно пределу разрешения оптической микроскопии, сформулированному в конце XIX века Эрнстом Аббе, равен примерно половине длины волны света, то есть 200–250 нанометров. Поскольку в клетке существует много структур, которые значительно меньше этого предела, — молекулярные структуры, некоторые клеточные органеллы, — хотелось бы видеть технологию с большим пространством разрешения. Но из-за дифракции света обычные микроскопы не позволяют этого достигать. Поэтому в таких случаях приходится использовать электронную микроскопию, которая хотя и может работать даже на атомарном уровне и в нанометровой шкале, но требует фиксации клеток. В связи с этим с такой технологией невозможно работать с живыми клетками.

Рекомендуем по этой теме:
6398
FAQ: Нанобактерии

Кроме того, в электронной микроскопии трудно пометить молекулу, которую вы хотите исследовать. Вы видите очень высокоразрешающую картинку, но где находится интересующая вас молекула (например, белок, который вы изучаете), увидеть довольно сложно. Флуоресцентная микроскопия, наоборот, позволяет очень специфически метить целевые структуры.

Таким образом, в сверхразрешающей микроскопии есть два преимущества: вы можете работать с живыми клетками и метить целевые структуры молекулы с помощью флуоресцентных красителей и флуоресцентных белков. Достигается это двумя основными способами — STED и методом детекции одиночных молекул.

STED — это технология, в которой существуют два лазера. Один из них — возбуждающий — светит в центр, а вокруг него бубликом располагают гасящий лазер. И этот второй лазер тушит все вокруг небольшого пятнышка, которое может быть нанометрового размера. Сканируя этими двумя лазерами с ярким центром, вы проходите по всему образцу и видите очень тонкую структуру с разрешением в нанометры. Эта система еще называется наноскопией.

Второй метод совсем другой. Он основан на детекции одиночных молекул.

Если вы детектируете флуоресценцию от одной молекулы, то с помощью компьютера вы можете поставить в центр этого пятна маленькую точечку, которая соответствует вычисленной позиции флуорофора. Для этого надо знать, что это одна молекула, а не много. Если вы уверены в этом, то можно очень точно вычислить центр положения флуорофора, центр пятна. Если вы таким образом сфотографируете множество молекул и все эти центры поместите на одну картинку, у вас сложится картинка сверхвысокого разрешения. Но для этого надо сфотографировать порядка 100 000 или 1 000 000 молекул. Только тогда будет получено достаточно подробное изображение. Это достигается с помощью фотоактивированных флуоресцентных белков или фотоактивированных флуоресцентных химических красителей путем последовательной фотоконверсии и получения изображений некоторого количества одиночных молекул. За один раз вы сфотографируете, например, 100 молекул, потом вы их уничтожаете, они фотоотбелятся, поскольку они сгорают в ярком свете. После этого вы фотографируете следующие 100 молекул, потом следующие, пока не накопите достаточное количество молекул, чтобы получилось хорошее изображение. Этот тип микроскопии иногда называется «пуантилизмом» по аналогии с художниками, которые рисовали точечками.

В целом эта новая технология позволяет видеть в живой клетке очень тонкие структуры, которые ранее были недоступны для прямой визуализации. Таким образом, возрастает детализация получаемой информации. Причем поскольку разрешение возросло на порядок, то, соответственно, информации для исследований стало поступать очень много.

Например, эту технологию используют при изучении цитоскелета. Есть несколько типов белков, которые формируют в клетке цитоскелет, — микротрубочки, микрофиламенты, промежуточные филаменты. Это очень важно во всей деятельности клетки — в подвижности, в организации ее формы, транспорта везикул, молекул, в делении клетки и так далее. Размер микрофиламента — 6 нанометров в поперечнике. Чтобы их рассмотреть, нужна микроскопия высокого разрешения. Дальше можно рассмотреть тонкую организацию сложных органелл, например митохондрий. То, что было видно только в электронный микроскоп, теперь можно посмотреть в живой клетке.

Кроме того, активно изучается прохождение нервного импульса. В синапсах происходят процессы экзоцитоза и эндоцитоза, когда везикулы с нейромедиатором выбрасываются в синаптическую щель. А потом они должны обратно собраться и восстановить свое состояние. Эти везикулы и синапсы очень маленькие. Теперь вы можете за ними следить, и по тому, как они сливаются с плазматической мембраной, можно делать интересные выводы.