Применение флуоресцентной микроскопии в диагностике

Сохранить в закладки
6393
1
Сохранить в закладки

Физик Юрий Вайнер о регистрации экзосом, плазмонном резонансе и микрофлюидных чипах

Как регистрировать наночастицы, переносящие информацию о болезнях? Какие методики позволяют повысить эффективность регистрации экзосом? Как использование микрофлюидных чипов изменит раннюю диагностику заболеваний? На эти и другие вопросы отвечает доктор физико-математических наук Юрий Вайнер.

Я хочу рассказать о новом направлении исследований, которые мы начали проводить в последнее время. Они носят прикладной характер и возникли во многом случайно. Дело в том, что я всегда, когда объявляются результаты вручения Нобелевской премии, рассматриваю, за что дано, причем не только по физике и химии, но и по другим наукам, в частности по биологии и медицине, — это очень полезная информация, и надо ее знать.

В 2013 году, когда была дана Нобелевская премия по биологии, она меня очень заинтересовала. Было награждено открытие механизма внутриклеточной передачи информации и вещества. Внутри клеток образуются маленькие наночастицы, везикулы, которые двигаются внутри клетки от одного фрагмента, так называемой органеллы, к другому, и при этом они переносят различные вещества, в том числе микроДНК и РНК, то есть они переносят и информацию, и химические вещества. Такая бутылочная почта. Причем, если эта микровезикула отходит от какой-то органеллы, она попадает не в любое место, а только в ту органеллу, которая ее ждет, потому что на этой везикуле есть «ключик», а у органеллы, которая ее ждет, есть «замочек», и она ее примет. Это настоящая бутылочная почта.

Конечно, когда это описывалось, говорилось, что примерно такой же механизм действует и между клетками. То есть клетки выбрасывают, например, в кровь или в какую-то жидкость, в которой они находятся, «бутылочки»-везикулы — они называются экзосомами, — которые несут информацию о клетке. А поскольку мы занимаемся регистрацией наночастиц, я подумал: интересно эти наночастицы регистрировать. Дело в том, что эти наночастицы, экзосомы, несут информацию о состоянии клетки, в том числе о болезнях. Значит, можно угадывать болезни. Я стал читать литературу. Действительно, люди этим интересуются. В последнее время бурный интерес, и все хотят научиться регистрировать эти экзосомы, чтобы определять, например, рак или другие болезни.

Но это сделать не очень просто. Много проблем. Первая проблема — размеры. Эти частицы очень маленькие, от 30 до 100 нм, и практически прозрачные. В микроскоп обычно они не видны. Они присутствуют во всех биологических жидкостях: и в слюне, и в слезах, и в сперме, и в моче, в чем угодно.

Рассмотрим случай крови. В одном микролитре плазмы крови находится примерно 3 млн таких частиц. Предположим, мы хотим провести раннюю диагностику рака мозга. Значит, из этих 3 млн частиц мы должны поймать нужные. Как это сделать? Это непросто. Второе. Мы выделили — как их зарегистрировать? Третье. Как не ошибиться, что они нужные? Сказать человеку, какой у него диагноз, а потом выяснится, что это не так, — это серьезная проблема. На самом деле все эти проблемы можно решить.

Первое — как выделить нужные экзосомы? Для этого не надо ничего придумывать и изобретать. Это придумал сам организм. В организме существуют антитела. Организм может вырабатывать антитела на любой антиген. Антигеном называется то, что вредно для организма. Обычно это вещества или частицы маленького размера. Например, мы хорошо знаем: когда попадают вирусы, то организм начинает вырабатывать антитела на эти вирусы.

Сейчас существует целая отрасль, и ученые научились искусственно вырабатывать антитела в искусственных условиях. То есть берется какая-то плазма крови или еще что-то, вводятся антигены, и нарабатываются антитела. Причем эти антитела можно купить. Более того, существуют технологии, как, например, нанести эти антитела на поверхность пластинки. Таким образом, если мы нанесем на поверхность пластинки антитела, очистим кровь, выделим экзосомы и пустим параллельно этой пластинке, то антитела сами захватят интересующие нас частицы. Остальное все уйдет, можно смыть водой.

Как их регистрировать? Есть разные методы. В том числе можно эти частицы пометить флуоресцентными молекулами. Поскольку мы занимаемся регистрацией флуоресцентных одиночных молекул, мы можем регистрировать одну молекулу.

Значит, мы можем зарегистрировать одну экзосому, то есть на самой ранней стадии рака, как только появились антитела, мы могли бы его определить.

Но какова ошибка? Очень важно не ошибиться, когда это регистрируешь, ведь, чтобы выделить эти экзосомы, частицы, вы используете какое-то устройство, какие-то фильтры и так далее. Идеальных устройств и фильтров нет. Значит, у вас обязательно будут нужные вам выделенные экзосомы и ненужные.

Во-вторых, антитела тоже неидеальные. Это очень трудно проверить: они на 100% присоединяют нужные нам экзосомы или будут иногда ошибаться. Это еще надо исследовать. Какая ошибка — тоже не известно.

Кроме того, возьмем эту пластинку: может быть, эти флуоресцентные молекулы сядут не только на эти экзосомы, может быть, они сядут где-нибудь рядом. Поэтому очень важный вопрос — это достоверность этого определения.

Следующий важный вопрос. Весь мир бросился разрабатывать такие диагностики. Наш коллектив далеко не самый богатый, не лучше всех оснащенный и имеющий не самый лучший опыт в биологии, поэтому, если мы хотим этим заниматься, мы должны иметь какое-то конкурентное преимущество. У нас должна быть какая-то своя идея или какой-то подход, и только тогда мы можем рассчитывать на успех. Повторять то, что другие делают, — бессмысленно.

И мы решили сделать упор именно на достоверность. Коллектив людей, с которым мы сотрудничаем, разработал одну из методик диагностики таких частиц, основанную на плазмонном резонансе. Причем их методика отличается от тех, что существуют в мире, тем, что они могут обнаружить одну частицу, считать на уровне одиночных частиц. А мы будем параллельно метить эти частицы флуоресцентными метками и определять. То есть на одной пластинке будет работать сразу два метода. Одним методом вы зарегистрировали 50 частиц, из них, предположим, 20 ошибочных. Мы своим методом зарегистрировали, предположим, 40, из них 15 ошибочных. Те, что не совпадают, отбрасываются, а те, что параллельно регистрируются обоими методами, берутся. Значит, резко повышается достоверность метода. И в этом наша особенность. Мы не знаем никаких подобных разработок или идей.

В настоящее время исследования будут проводиться тремя коллективами: один коллектив из Германии — плазмонным резонансом; один коллектив наш — флуоресцентными метками; и один коллектив — это Украина, Запорожье, это люди, которые занимаются биологической частью работы.

Мы решили на первом этапе заниматься диагностикой не рака, а заболеваний сердца. Это легче. На самом деле методика примерно та же самая. В случаях заболеваний сердца есть два вида частиц. Когда сердце начинает испытывать какую-то недостаточность, то появляются мертвые клетки, в крови увеличивается содержание апоптозных клеток — клеток, возникающих в результате распада сердечной мышцы. А организм начинает тут же организовывать клетки, которые способствуют заживлению — сердечная мышца должна расти быстро, она не может ждать. Это одна из наиболее быстрорастущих тканей.

Сердечная мышца всегда растет. То есть клетки — и апоптозные, и обычные — есть всегда. Но соотношение между ними зависит от состояния сердца. У здорового человека соотношение другое. А у больного человека резко меняется соотношение и количество этих клеток. И, меряя соотношение этих клеток, мы собираемся диагностировать заболевания сердца на ранней стадии. Это первый этап наших исследований. Потом мы перейдем к диагностике рака.

Предположим, мы разработаем методику. Но дело в том, что существующие методики, которые мы используем, дорогие, установки сложные. Мы сделаем такую методику, она даже будет работать. Предположим, даже где-то в клинике выставить, но нормальные люди не приходят в дорогую клинику сделать сложный анализ. Конечно, желательно разработать достаточно простой прибор, который будет доступен, чтобы люди могли себя проверять.

Преимущество нашей методики заключается в том, что она рано обнаруживает, когда у человека нет еще никаких признаков, когда люди точно не ходят к врачам.

И здесь есть еще одно направление, которым мы еще не начали заниматься, но в ближайшее время собираемся, — это использование микрофлюидных чипов. В настоящее время это целое направление. Это маленькая лаборатория, которая все делает автоматически. Эта лаборатория имеет размер, скажем, миллиметры или сантиметры, но она одноразовая. Там сделаны какие-то капилляры, насосики, фильтрики и так далее. Один раз использовали — и выбросили. Разработка такого чипа — это очень дорого, и производство его сложное.

Но возьмите автомобиль или компьютер. Когда производство массовое, они становятся дешевле. Если такие микрочипы производить массово, то они будут дешевыми. И тогда получится следующая вещь: купили микрочип, зака́пали в него каплю крови и отнесли в лабораторию, где есть сложный прибор. Может быть, в реальном будущем будут более простые приборы. И таким образом можно эту задачу упростить. Это одно из последних направлений в медицинской диагностике.

Причем это относится не только к нашей тематике. Разработка микрочипов сейчас — это целое направление медицины для самых разных целей. В частности, вы избегаете плохих лаборантов, которые плохо помыли какой-то прибор, что-то занесли. Это все сделано в заводских условиях, и вы выбрасываете. Как одноразовые шприцы — освоили их, они стали дешевыми, так сейчас идет разработка и микрофлюидных чипов. Это очень интересное направление, к которому мы тоже примкнем.

Над материалом работали

Читайте также

Внеси свой вклад в дело просвещения!
visa
master-card
illustration