Молекулярные колонии в диагностике

Проблема неспецифического размножения

В молекулярной диагностике нужно обнаружить определенные молекулы ДНК и РНК, которые ассоциированы с какой-то болезнью — например, с некой инфекцией, СПИДом или с такой болезнью, как рак. Для этого молекулы делают видимыми, потому что одиночные молекулы напрямую никто видеть не может. Если молекулу размножить и наблюдать продукт размножения, то можно определить, есть ли в организме такие молекулы или нет.

Проблема с ПЦР заключается в том, что, помимо размножения целевых молекул, то есть тех, которые мы хотим обнаружить, наблюдается так называемый неспецифический синтез, неспецифическое размножение. Это связано с тем, что в биологическом образце, в частности в клиническом образце, который получают от пациента, целевые молекулы составляют ничтожную долю от всех молекул ДНК и РНК, примерно одну триллионную долю. То есть нецелевых молекул в образце примерно в триллион раз больше, чем целевых молекул.

Таким образом, целевые молекулы оказываются в невыгодных условиях. Полимераза хочет их размножить, но из-за того, что она временами ошибается, она случайно размножает и нецелевые молекулы. И когда такое неблагоприятное соотношение — когда нецелевых молекул в триллион раз больше, чем целевых, — то размножаются преимущественно чужие, нецелевые молекулы, а целевые оказываются неразмноженными. То есть даже если болезнь существует в организме, она не будет обнаружена.

Конкуренция молекул

В случае использования молекулярных колоний проблему можно обойти. Почему? Потому что целевые и нецелевые центры размножения находятся пространственно в разных местах, они разделены, поскольку размножение происходит в геле. Поэтому конкуренции нет. Как если бы вы, допустим, людям из тесной комнаты дали возможность разбежаться на большую площадь. Там каждый имеет свой кусочек, свой уголок, и никто другому не мешает. То же самое и здесь. Конкуренция между молекулами исчезает, и они начинают размножаться так, как если бы других, посторонних молекул не было.

Поэтому оказывается, что, благодаря использованию молекулярных колоний, можно увеличить чувствительность диагностики примерно в 100–1000 раз по сравнению с той ПЦР, которая в настоящее время используется в клинической практике. Также можно увеличить и специфичность, потому что вы можете в таком случае смотреть за каждой одиночной колонией и видеть ее развитие во времени, то есть то, как колония растет. Таким образом вы можете точно отличить истинные молекулярные колонии от, к примеру, светящегося мусора, который не изменяется со временем, и значительно повысить чувствительность, точность и надежность диагностики.

Использование молекулярных колоний

К сожалению, сейчас молекулярные колонии используются пока только в лаборатории. Помимо нашей лаборатории, еще в нескольких лабораториях, в том числе в Соединенных Штатах, но этот метод еще не получил широкого распространения. Почему? Потому что, в отличие от ПЦР, для которой все необходимые компоненты существуют на рынке, для реализации метода молекулярных колоний не хватает одного элемента — кассеты, которую можно использовать для выращивания колоний.

Что она собой представляет? Это обычное предметное стекло для микроскопии, в котором сделаны мелкие лунки. В эти лунки заливается гель, в котором идет размножение ДНК и РНК. Такая лунка потом закрывается покровным стеклом и герметизируется липкой фольгой для того, чтобы не происходило испарения образца в процессе реакции размножения, когда идет образование колонии. Кроме того, есть прозрачное окошечко, через которое можно видеть светящиеся флуоресцирующие колонии, когда они там образуются. Если бы такие кассеты продавались на рынке, то все желающие могли бы их использовать.

Есть еще более продвинутый вариант, который мы разработали совместно с Институтом приборостроения из Санкт-Петербурга. Но это все-таки институт, там не могут производить что-то в больших масштабах. Только из-за этого не получает широкого распространения такой прекрасный метод диагностики.

Перспективы применения молекулярных колоний в диагностике

К сожалению, в России нет ни одной компании, желающей использовать этот метод, который является уникальным изобретением и опережает по своему технологическому уровню то, что сейчас есть на Западе.

А в западных странах пока не хотят его использовать по той простой причине, что очень многие фирмы вложились в разработку ПЦР, в частности количественной ПЦР, жидкостной ПЦР, и называют это real-time ПЦР, то есть ПЦР в реальном времени. Они хотят сначала окупить свои затраты, получить прибыль от ПЦР. Одна фирма купила лицензию на наш патент по молекулярным колониям, но применять эту технологию на практике пока не собирается.

Надеюсь, что рано или поздно найдутся бизнесмены, которые захотят осчастливить человечество и сделать такой подарок. Это очень простая в изготовлении кассета. Может быть, ее надо немного доработать, чтобы сделать производство дешевым и легким, чтобы это существенно не увеличивало стоимость анализа по сравнению с обычной ПЦР. Думаю, результаты будут очень хорошие, главное — оправданные, потому что можно будет совершенно точно сказать, болен ли какой-то определенный человек, например, СПИДом или раком и необходима ли ему помощь. А чем раньше обнаружена болезнь, тем, как известно, легче ее лечить и предотвратить ее распространение.

Прежде чем этот метод пойдет в серию, необходимо провести клинические испытания. Сейчас мы проводим такие испытания, хоть и в маленьких масштабах, потому что наша производственная база очень мала. Мы можем производить в мастерской ограниченное количество подобных кассет, необходимых для диагностики. В частности, мы ведем совместные исследования с Онкологическим центром. Там наши коллеги дают нам клинические образцы, для того чтобы мы могли набрать статистику и, в частности, обнаружить, какие маркеры РНК или ДНК являются наиболее надежными для диагностики рака.