В начале XXI века был расшифрован геном человека. Случился большой прорыв. Появилась новая наука — геномика, но выяснилось, что она имеет свои ограничения. Когда были расшифрованы геном человека и геномы основных организмов, выяснилось, что в них очень много белых пятен. Много белков, где известна первичная структура, а функция неизвестна. От первичной структуры функция зависит очень мало. И поэтому нужно понять, как этот белок организован в трехмерном пространстве.

Какие бывают структуры белка? Первичная, вторичная, третичная и четвертичная. Первичная структура — это то, что закодировано в ДНК, последовательность аминокислот. То, что пишется буковками. Но эти буковки, как только попадают в цитоплазму клетки и начинают взаимодействовать в водных растворах с ионами, не останавливаются в длинной веревочке, а начинают сворачиваться.

Рекомендуем по этой теме:
6549
Фолдинг белка

Сворачиваются они двумя типами. Это либо альфа-спирали, либо бета-листы. Альфа-спираль похожа на телефонный шнур. Бета-листы — это когда ваш шнурок расположен в плоскости то в одну сторону, то в другую. Получается плоский лист. Это вторичная структура.

Когда эти отдельные элементы начинают организовываться в трехмерном пространстве, получается третичная структура. Есть еще четвертичная структура, включающая в себя несколько отдельных полипептидных цепей, то есть отдельных белковых молекул или отдельных доменов, которые объединяются вместе в один белковый комплекс. Очень часто функция белка связана не с первичной структурой, а с третичной или четвертичной.

Например, ионные каналы. Они проводят ионы через мембрану. При этом большинство из них специфично. Есть ионные каналы, которые проводят ионы натрия. Есть ионные каналы, проводящие ионы калия. Например, натриевые ионные каналы — это один длинный белковый полипептид, который организован в несколько доменов. Эти домены, когда соединяются вместе, образуют пору, через которую могут проводиться ионы. Калиевый канал устроен немного по-другому. Его функция зависит от четвертичной структуры. Когда несколько белковых доменов соединяются вместе, в месте соединения образуется пора, ионы начинают проходить. Функция зависит от структуры, поэтому нам нужно знать структуру белка.

Как мы можем ее узнать? Есть несколько давно разработанных методов. Это началось в начале XX века, очень сильно развивалось до и после Второй мировой войны. Один из первых методов изучения структуры — рентгеноструктурный анализ. Для этого нужно кристаллизовать белок, то есть расположить белковые молекулы так, чтобы у них было одинаковое расположение в узлах кристалла. При этом образуется много слоев. Получается действительно большой кристалл, который можно наблюдать. Невооруженным глазом его трудно увидеть, но можно увидеть в световой микроскоп. Бывают еще очень маленькие кристаллы, так называемые нанокристаллы, но в рентгеноструктурном анализе они не используются, потому что дают не очень хорошие данные.

Дальше вы помещаете белковые кристаллы в пучок рентгеновских лучей, и на каждой белковой молекуле идет дифракция рентгеновских лучей. Вы записываете рентгеновскую дифракционную картину. После чего с помощью специальных манипуляций вы получаете структуру белка. Лучше всего, если вы можете получить структуру белка с высоким разрешением. Размер атомной связи обычно 0,1 нанометра. Единица для этого 0,1 нанометра называется ангстрем в честь шведского ученого Ангстрема. Вы можете полностью увидеть структуру белка, если получаете структуру с разрешением 1,5–2 ангстрема. Для тех, кто занимается рентгеноструктурным анализом, 5, 6 или 7 — это уже очень плохо. Они говорят: «У нас ничего не получилось. У нас получились кристаллы, у которых дифракция до 5 ангстрем. Это очень плохо».

Рекомендуем по этой теме:
2442
Белки в свете рентгеновских лучей

В 60-е годы XX века с помощью просвечивающей электронной микроскопии начали активно изучать структуру белков — по крайней мере пытались. Сначала их изучали в так называемом негативном контрастировании. Белки наносили на подложку, которую можно было поместить в электронный микроскоп, и сверху покрывали раствором солей тяжелых металлов. Тяжелые металлы — это, например, уран, молибден. Соли тяжелых металлов покрывали эти белковые молекулы. В результате они спасали их от радиационного повреждения. Таким образом пытались изучать. Сначала начали с крупных молекул, потому что чем крупнее молекула, тем проще ее увидеть. Изучали большие вирусы, изучали бактериофаги, большие растительные вирусы, которые имеют спиральную структуру.

В 1980-е годы придумали криоэлектронную микроскопию. Люди пытались сравняться в разрешении с рентгеноструктурным анализом. Изначально это было очень сложно. Например, самые первые работы по рентгеноструктурному анализу Макса Перуца уже были опубликованы с разрешением 2–3 ангстрема. Это было уже атомное разрешение. Можно было увидеть отдельные альфа-спирали этого белка и понять, как устроена его третичная структура. Первыми закристаллизованными белками были гемоглобин и миоглобин — гемсодержащие белки. Железо — это тоже тяжелый металл, и уже поэтому их было видно. Соответственно, рентгеноструктурный анализ всегда был впереди, и все остальные структурные методы за ним тянулись. Но как можно сравнить? Зачем вообще использовали электронную микроскопию? Взяли рентгеноструктурный анализ, и давайте все, что можем, закристаллизуем и получим прекрасные структуры.

У рентгеноструктурного анализа есть ограничения. Например, не все белки кристаллизуются. Мембранные белки плохо кристаллизуются, подвижные части белков тоже. Поэтому, например, когда делают рекомбинантные белки для кристаллизации, эти подвижные части просто отрезают. Там есть длинные петли, и мы отрежем петлю, сделаем маленький линкер, чтобы остались только неподвижные части, тогда кристаллизуется хорошо.

Кстати, первому ученому, который закристаллизовал ионный канал, Родерику Маккинону, дали Нобелевскую премию через пять лет после того, как он опубликовал первый ионный канал. В 1998 году он опубликовал первый ионный канал, кристаллическую структуру, и в 2003-м ему уже дали Нобелевскую премию по химии. К этому времени он опубликовал еще несколько структур ионных каналов. Но он все отрезает. Сейчас он, кстати, тоже начал заниматься криоэлектронной микроскопией, но по привычке отрезает все подвижные части — на всякий случай, видимо. Если мы хотим иметь структуру тех белков, которые очень сложно кристаллизовать, то нам нужно пытаться найти другой метод, например электронную микроскопию.

Возвращаясь обратно к функции, скажу, что у очень многих белков структура определяет функцию. Например, здесь можно упомянуть различные ферменты. Это классический пример, когда фермент связывается с субстратом, он меняет свою конформацию, и обычно есть специальное место в третичной структуре, где связывается субстрат. Это еще одна проблема для рентгеноструктурного анализа. Для рентгеноструктурного анализа все белки должны быть одинаковы. Если, например, вы добавляете к ферменту какой-то субстрат, то некоторые молекулы фермента субстрат свяжут, а некоторые не свяжут, и они опять получатся разные и плохо кристаллизуются.

Таким образом, в 80-е годы XX века выяснилось, что рентгеноструктурный анализ — это не единственная панацея для тех, кто хочет получить структуру с высоким разрешением. И поэтому ученые во многих странах, в том числе и в СССР, и в Америке, и в Европе, занялись разработкой других методов. За эти другие структурные методы потом некоторые ученые, которые начинали исследования, получили Нобелевские премии по физике или по химии. А научное сообщество получило новые интересные возможности для своих исследований.