Первые два десятилетия после возникновения молекулярной биологии, после открытия двойной спирали Уотсоном и Криком было очень много понято относительно молекулярной природы жизни, была сформулирована знаменитая центральная догма, был полностью расшифрован генетический код, который позволяет в клетке переводить тексты нуклеиновых кислот в тексты белков, последовательность нуклеотидов в ДНК и РНК — в последовательность аминокислотных остатков в белках. Это было огромное достижение в понимании молекулярных основ жизни.
Проблема, однако, состояла в том, что, хотя молекулярные биологи все время рассуждали про эти тексты, самих текстов никто не знал. Не было способа прочесть тексты генов и то, что находится между генами. Иными словами, не было метода определения последовательности нуклеотидов в ДНК.
Это умели делать для белков — метод чтения последовательности белков был разработан еще в начале 50-х годов, даже до открытия двойной спирали, умели немного читать короткие последовательности РНК, а последовательности ДНК не умели читать вообще. Это создавало колоссальную брешь в реальном понимании молекулярных основ жизни и сдерживало дальнейшее развитие биотехнологии, которой, собственно говоря, еще не было, и медицинское применение этих знаний.
В середине 70-х годов XX века произошел прорыв. К тому времени уже стало казаться, что это слишком сложная задача, что ее не удастся решить — все попытки оказывались безуспешными. Метод определения последовательности был разработан британским ученым-химиком Фредериком Сенгером.
Сенгер — великий человек, единственный в истории науки, кто получил две Нобелевские премии по химии. Нобель запретил давать два раза одному и тому же человеку премию по одной и той же области. А Сенгер к тому времени уже получил премию за разработку метода чтения аминокислотных последовательностей в белках. И когда он разработал метод чтения последовательности ДНК, Нобелевский комитет оказался в очень трудном положении: он должен был либо не дать человеку премию за выдающееся открытие, либо нарушить завещание Нобеля. Решили все-таки в данном случае нарушить завещание, хотя делают это крайне неохотно. Это единственный случай в области химии. Аналогичный случай есть еще в области физики, и все.
Как теперь читают последовательности ДНК? С тех пор в этом направлении имеется колоссальный прогресс, и он основан на прорыве, который сделал Сенгер. Если мы говорим о длинной последовательности ДНК, скажем, мы хотим определить последовательность всего генома человека, что сейчас уже делают очень легко, — это колоссальной длины текст. У нас в каждой клетке имеется геном, который состоит из трех миллиардов нуклеотидов, трех миллиардов звеньев. Это такой текст: A T G C A T G G G A T T T C C — что-то в таком духе, длиной в три миллиарда. Это текст, который надо прочесть. Это не одна молекула ДНК — на самом деле их 23, потому что у нас 23 хромосомы, все равно каждая молекула страшно длинная и содержит сотни миллионов звеньев.
Как же это прочесть? Прежде всего, эту ДНК рубят на куски с помощью специальных ферментов, которые называются «рестриктазы». Рестриктазы узнают короткие последовательности ДНК, содержащие приблизительно от 6 до 8 нуклеотидов, и только в этом месте совершенно определенным образом разрезают двойную спираль ДНК. То есть были открыты такие «ножницы», это тоже был прорыв в начале 70-х годов, когда были открыты эти ферменты, обнаружены в бактериальных клетках, которые производят такие разрезания, такие очень специфические «ножницы». Их много разных, поэтому можно порезать ДНК на короткие куски одним способом, совершенно другим способом, третьим способом, четвертым способом. Это сделать достаточно легко.
Дальше c помощью метода, который называется «гель-электрофорез», молекулы ДНК очень аккуратно разделяются по длине.
И задача теперь сводится к тому, чтобы определить последовательность короткого куска — он может содержать сотню или несколько сотен звеньев. Здесь используется метод Сенгера.
К такому фрагменту молекулы добавляются с обоих концов специальные адаптеры, потому что рестриктаза оставляет неровные концы, когда выступают однонитевые участки, и, используя эти однонитевые участки, можно добавить адаптер. Адаптер будет иметь определенную последовательность, которую мы выбрали, он синтетический. Таким образом, каждый фрагмент теперь имеет совершенно определенные последовательности на концах, которые мы знаем. И мы можем использовать эти известные последовательности для того, чтобы добавить к этим фрагментам праймеры, начиная с которых будет по имеющейся последовательности ДНК синтезироваться комплементарная цепочка.
Идея Сенгера состояла в том, что, когда такой синтез происходит, нужно добавить к смеси нормальных предшественников нуклеотидов, называющихся трифосфатами, такие, которые не смогут удлиняться. Это специальная химическая модификация сахара в нуклеотиде — такая, что если этот добавленный нуклеотид встраивается в цепочку, то ДНК-полимераза не может его дальше продлить. Образец разбивается на четыре части, и к каждой части, наряду с нормальными трифосфатами, добавляются трифосфаты химически модифицированных оснований.
Когда комплементарная цепочка синтезируется с помощью ДНК-полимеразы, она с некой вероятностью останавливается тогда, когда случайно встраивается этот модифицированный нуклеотид. В результате в нашем образце, в котором у нас имеется огромное количество одинаковых молекул, на которых идет синтез, мы получаем набор всех молекул, у которых данная буква, скажем, Т или А, которую мы в данном случае добавили к пулу этих предшественников, мы добавили модифицированный предшественник, мы получаем остановку синтеза на этом месте. Тем самым мы имеем длины молекулы, которые точно говорят нам, в каком месте эта буква встроена. И тогда остается только разделить эти молекулы по длине, что делается при помощи гель-электрофореза. Он позволяет разделять эти молекулы по длине, и там, где стоит данный нуклеотид, который мы в данный момент изучаем, мы будем видеть остановку синтеза, то есть длины фрагментов, когда мы будем разделять их по длине, соответствующие номеру этих нуклеотидов, когда, скажем, буква Т стоит в последовательности. Так делается для буквы T, для буквы A, для буквы G и для буквы C, и таким образом мы читаем всю последовательность.
Это замечательный, гениальный метод чтения последовательностей, придуманный Сенгером. Он позволил в конечном счете секвенировать человеческий геном — как говорят для последовательности генома. И теперь, начиная с первого генома человека, который был прочитан в самом начале нашего века и который обошелся в гигантские деньги, порядка тех же трех миллиардов, только долларов, благодаря тому, что эти методы были роботизированы и сильно модифицированы, теперь несравненно дешевле стоит определить последовательность. Цена приближается к 1000 долларов — определить последовательность индивидуального человека. Уже секвенированы тысячи геномов людей, и они анализируются. Это совершенно неимоверное развитие методов секвенирования ДНК создало неимоверный прогресс и в области понимания молекулярной природы жизни, и в применении к биотехнологии и медицине.
