История началась в 1982 году, когда Бинниг и Рорер, сотрудники фирмы IBM — она в этом счете очень плодовита, — изобрели новую методику, новый прибор, который позволял визуализировать отдельные атомы. Этот прибор использовал в основе своей работы принцип туннелирования: когда вы очень близко подвигаете два проводника, подаете разность потенциалов между ними, то на очень-очень близком расстоянии, соизмеримом с длиной связи или с размером атома, возникает электрический ток. Этот электрический ток не подчиняется омическому закону — он имеет экспоненциальную зависимость от напряжения. Он носит квантово-механический характер — это так называемый туннельный ток.
Поскольку он очень локализован, то, если вы каким-то образом (изобретатели туннельного микроскопа поняли как) сможете сканировать поверхность этим проводником и либо измерять ток во время сканирования, либо, наоборот, ток поддерживать постоянным, вы можете получить очень-очень высокое разрешение. Грубо говоря, в таком режиме вы будете видеть отдельные атомы.
Тут же, когда это изобретение было сделано, люди попытались применить это к визуализации биологических объектов. Это оказалось непросто, потому что большинство биологических молекул в широком диапазоне условий не проводят электрический ток. Поэтому невозможно получить туннелирование, подавая потенциал на поверхность, где расположены молекулы и зонд.
Чуть позже, в 1986 году, был изобретен атомно-силовой микроскоп, когда сканирование осуществляется не проводящей иглой, как в туннельном, а очень острым зондом, иголочкой, сделанной, скажем, из кремния или из нитрида кремния. И эта иголочка сканирует поверхность, в каждой точке измеряется сила взаимодействия этой иголки с поверхностью. Сила ничтожна, и для этого используются специальные устройства, так называемые кантилеверы — это тонкая балка, которая может изгибаться, и на ней закреплена тонкая иголка. Сканируя поверхность, вы видите микрорельеф — это аналог того, как слепой человек ощупывает поверхность и создает представление о том, что его окружает, какие предметы. То же самое происходит, когда иголка сканирует поверхность. Еще некий аналог — это патефоны, которые раньше были, когда идет иголка, попадает в канавки, и механические колебания возникают, потом они усиливаются, и возникает звук.
Тот же принцип используется и в атомно-силовом микроскопе. Надо сказать, что сразу возникало большое количество методических проблем. Во-первых, молекулы должны быть на какой-то поверхности закреплены. Во-вторых, эта поверхность должна быть ровная, она не должна вносить какие-то искажения или какой-то свой собственный рельеф накладывать на микрорельеф этих молекул. И нужно ухитриться модифицировать ее таким образом, чтобы была существенная адгезия и чтобы в то же время вы имели возможность наблюдать непосредственно сами молекулы, а не поверхность. Силы оказались небольшими, но все-таки существенными для того, чтобы молекулы просто как бульдозером раздвигались.
Было предпринято достаточно большое количество попыток, чтобы минимизировать силы, возникли резонансные методики, которые в основе использовали уже не сканирующий зонд, а зонд, который вибрировал на собственной частоте.
Разрешение этого метода атомно-силовой микроскопии связано непосредственно с радиусом кривизны иголки, которой вы ощупываете поверхность.
Аналог здесь может быть таким: когда каток движется по булыжной мостовой, вы почувствуете вибрацию того, что он взаимодействует с каждым кирпичом. Но если одного кирпича не будет хватать, то вы этого никогда не почувствуете, в силу того что сам каток намного больше, чем эти кирпичи, по которым он движется. То же самое происходит и с зондом, только на уровне атомов. Зонд по сравнению с атомами достаточно большой. Это классический зонд, который доступен с помощью фотолитографии и массового производства.
Мы задались целью улучшить его характеристики и научились с помощью низкотемпературной плазмы в условиях, близких к формированию алмазоподобных и алмазных пленок, выращивать на острие кремниевого зонда очень тонкие иголочки из алмазоподобного углерода. Эти иголки оказались с достаточно воспроизводимой точностью очень острыми. Радиус кривизны, радиус закругления этих зондов оказался около одного нанометра и даже чуть меньше. То есть всего-навсего десять атомов углерода. И такими острыми зондами мы смогли существенно улучшить качество получаемой информации.
Приведу пример: мы смогли на молекулах ДНК разглядеть спираль — спиральный период, который в классических работах Уотсона и Крика был предложен, что молекулы ДНК закручены в спираль. Но если использовать классические зонды, вы не увидите никакой спирали — будет достаточно сглаженная линия. Дальше на кристаллах полимеров можно было видеть отдельные вакансии размером всего-навсего пять ангстремов, несколько атомов, что невозможно классическими зондами, которые использовались до этого.
На сегодня эти зонды являются самыми острыми в мире, хотя уже достаточно долго мы их эксплуатируем, но никому не удалось сделать острее. Может быть, это уже предел в каком-то смысле, потому что десять ангстремов — это очень маленькие расстояния.
Что касается конкретных результатов, которые мы получили, используя эти сверхострые алмазоподобные зонды. Во-первых, мы существенно увеличили разрешение на молекулах ДНК. Зачем это нужно? Один из возможных вариантов применения — это секвенирование ДНК, то есть прочтение последовательности, которая в ней заложена, прочтение генетической информации. Для этого нужно иметь возможность получать данные о соседних основаниях в ДНК. И расстояния между этими основаниями около трех ангстремов, хотя недавние работы показали, что молекулу ДНК можно вытягивать и она не рвется вплоть до шести ангстремов между основаниями. И, в принципе, это уже достаточно для того, чтобы, применяя сверхострые зонды, получить информацию о генетической последовательности. Мы говорим о гипотетическом применении этой технологии для секвенирования отдельных молекул, то есть для прочтения генетической информации отдельных молекул.
Другим примером является исследование молекул фибриногена. Это очень распространенный белок — у нас в крови его почти половина. Это очень крупный белок. Он состоит из нескольких доменов, соединенных между собой спиральными участками. Его изучали с 60-х годов методами электронной и просвечивающей микроскопии. Казалось бы, о его структуре известно уже все. Самое высокое разрешение, вплоть до определения координат отдельных атомов в молекуле, конечно, дает рентгеноструктурный анализ. Но, чтобы получить информацию, необходимо сделать, подготовить трехмерные кристаллы из этих молекул. Оказалось, что у них есть участки, так называемые αC-домены, которые не имеют заданной структуры, и ученые ухитрились их отрезать и получили трехмерные кристаллы без этих αC-доменов. И очень хорошо с высоким разрешением с помощью рентгеноструктурного анализа изучена структура молекул фибриногена, но без αC-доменов. А они занимают достаточно большую долю молекул.
Применяя сверхострые зонды, мы впервые пронаблюдали αC-домены. Оказалось, что они, во-первых, структурированы. Как пример я могу привести гантельку. Можете себе представить: из нее торчат веревочки или ниточки — так выглядит молекула фибриногена.
Этот белок отвечает за образование тромбов в крови, поэтому его изучение — принципов его работы, принципов олигомеризации — очень важно для медицины, для медицинских целей.
Для того чтобы помогать человеку, когда у него, допустим, тромбоз, или, наоборот, чтобы останавливать кровь, когда поранились. И все это происходит за счет процессов полимеризации молекул фибриногена.
Оказалось, что даже при полимеризации, при переходе фибриногена в фибрин, когда фибриноген активирован и способен образовывать большие фибриллы, большие агрегаты, αC-домены никуда не деваются, они участвуют в этом процессе, они участвуют в предварительном узнавании нескольких молекул. Они участвуют в образовании протофибрилл, то есть фибрилл на начальной стадии, в волокнах фибрина, которые очень хорошо изучены методами классической электронной микроскопии. Оказалось, что все эти волокна устроены таким образом, что из них эти нитки торчат во все стороны, то есть они представляют собой не просто волокно, а как бы мохнатую гусеницу.
Мы предположили, в чем их роль. Оказалось, что они способствуют первичному контакту молекул, чтобы их ускорить. Когда вы порезались, нужно, чтобы процесс образования тромба шел очень быстро, иначе вы потеряете много крови. Так вот, узнавание молекул, сближение происходит через взаимодействие αC-доменов. Оно неспецифично, то есть оно не имеет какой-то конкретной структуры, через которую идет это взаимодействие. Тем не менее оно способствует сближению молекул, и дальше уже эти молекулы, сближаясь, начинают взаимодействовать специфически. Это мы показали благодаря сверхострым зондам.
