Измерение сил биомолекулы

Макромолекулы в клетках развивают силы порядка пиконьютонов — по меркам нашего мира это величина, которую можно сравнить с силой давления лазерной указки на стену. Чтобы изучать внутриклеточные взаимодействия, нам нужно научиться производить столь же «легкие прикосновения» — с помощью света или магнитного поля. О том, как ученые меряются силой с белками и другими молекулами, рассказывает физик Никита Гудимчук.

Лазерные ловушки

Сегодня уже создано большое количество разных методов для измерения. Один из них основан на методе светового давления, и для него используется лазерная ловушка, которая представляет собой специальный инструмент для манипуляции микрообъектами. Лазерную ловушку изобрел Артур Эшкин. В ловушке имеется сфокусированный луч, и в его фокус затягиваются диэлектрические объекты и маленькие частицы: микросферы, шарики или бактерии размером от долей микрометра до нескольких микрометров.

Суть метода заключается в преломлении лучей этими частицами. Когда луч проходит через частицу, он отклоняется в сторону. Луч одновременно является волной и частицей, поэтому, отклоняясь, он передает импульс самой частицы. Лазерный луч имеет конкретный профиль интенсивности, наиболее мощный в центре и постепенно ослабевающий по мере продвижения наружу. Самые мощные лучи, проходящие через центр пучка, отклоняются в сторону и наиболее сильно отталкивают частицу в центр пучка. Лучи, которые проходят через частицу периферически, создают отталкивающую силу из пучка, но эта сила слабее. В итоге равнодействующая сила направлена в пучок, поэтому он способен удерживать частицы в центре своей оси. Вдоль распространения луча есть такая же точка интенсивности, в которой действует идентичный принцип.

Благодаря этим осям получается оптическая ловушка, которая позволяет удерживать объект в 3D-пространстве. Лучи становятся полноценными манипуляторами, с помощью которых можно передвигать объекты, например бактерии или специально созданные частицы.

Затем наша задача сводится к тому, чтобы прикрепить к специально созданному шарику молекулу, которая нас интересует. С помощью лазерной ловушки появляется возможность смотреть перемещения частицы. Например, если взять биологический моторный белок, то он будет тратить энергию химического превращения АТФ (аденозинтрифосфат. — Прим. ред.), чтобы совершить работу и переместить частицу.

Для большей информативности результатов необходимо дополнительно измерить количество силы, которую прилагает биологическая молекула. Чтобы это сделать, нужно совершить калибровку лазерной ловушки — использовать эталонный сигнал силы. Для этого берут микросферу и начинают ее перемещать с известной скоростью в вязкой жидкости. Изначально размер микросферы и скорость известны, поэтому легко вычисляется вязкая сила, по которой калибруется жесткость лазерной ловушки. В итоге получается небольшой динамометр, который позволяет измерять силы в диапазоне от 1 до 100 пиконьютонов. 

Одни из первых молекул, которые исследовали с помощью лазерной ловушки, — моторные белки, в частности белок кинезин, о котором сегодня много известно. Например, выяснилось, что кинезин может, передвигаясь по микротрубочкам, развивать силы 5–7 пиконьютонов, делая миниатюрные шаги размером 8 нанометров. Существуют другие моторы, которые движутся по актиновым филаментам (тип цитоскелетных нитей). Такие моторные белки развивают меньшие силы, чем кинезин. Бо́льшие силы развивают РНК-полимеразы — моторы, которые шагают вдоль ДНК, развивая силу около 20 пиконьютонов.

Атомно-силовой микроскоп

В очищенных системах, которые вычленяют из клетки для лучшего контроля, и в самих клетках складывается ситуация, когда к макромолекулам нужно прилагать силы больше 100 пиконьютонов. В таком случае выгодным инструментом будет уже не оптическая ловушка, а атомно-силовой микроскоп. У такого микроскопа есть миниатюрный гибкий зонд — кантилевер. На поверхность этого зонда светит луч лазера, который отражается и улавливается фотодетектором, поэтому расположение зонда точно известно. Поэтому при правильной калибровке изгибной жесткости зонда по его отклонениям можно судить о силе, прилагаемой к молекуле.

С помощью атомно-силового микроскопа можно развивать силы порядка наноньютонов. Такой метод позволяет разворачивать молекулы белков или ДНК. При атомно-силовом методе возможно совершать действия, которые подразумевают большие силы, чем при нековалентном или фермент-субстратном взаимодействии. 

Магнитные ловушки

В некоторых случаях, для аналогичных измерений выгоднее применить другой принцип — магнитные ловушки. Такая ловушка представляет собой ферромагнитный объект, который восприимчив к магнитному полю. Если создать неоднородное магнитное поле, то в нем объект будет отталкиваться от подложки. Между подложкой и ловушкой можно растянуть интересующую нас молекулу и изучать ее с помощью манипуляций, похожих на принципы работы атомно-силового микроскопа.

Изучение силы внутри клетки

Все три описанных метода используются только для исследования вычлененных из клетки систем. Исследования в самой клетке с помощью таких методов не получится провести. Для измерения силы, существующей внутри клетки, или силы, которую клетка оказывает на другие клетки, необходимы дополнительные технологии и способы.

Один из таких способов — эластичные наностолбики, которые можно нанести на поверхность подложки. Если нанести на эти столбики специальный межклеточный матрикс, то концентрация клетки на подложке с межклеточным матриксом, под которой находятся столбики, увеличится, поэтому столбики будут изгибаться под силой клетки. В итоге по наклону столбиков определяют, в каких областях и какого масштаба силы развиваются на поверхности клетки.

Другой метод, который используют для исследований сил в клетке, — метод FRET-сенсоров. Для него нужны две чувствительные к свету молекулы. Представим, что первая молекула — флуоресцентная краска, которая начинает светиться зеленым, когда ее облучают синим светом. Вторая молекула — краска, которую облучают зеленым светом, и она светится красным. Если эти краски находятся близко друг к другу, то между ними происходит резонансный перенос энергии — безызлучательный переход, который приводит к новому эффекту. При обычных условиях синий свет дает зеленый свет краски, но в присутствии смеси этих молекул можно посветить на смесь синим светом и сразу получить красный, а зеленого совсем не будет, потому что произошел резонансный переход энергии от одного красителя к другому.

Эффективность перехода энергии сильно зависит от расстояния между молекулами. Хорошая эффективность перехода означает, что расстояние лежит в пределах 2–5 нанометров. Отсутствие перехода означает, что расстояние сильно больше 2–5 нанометров. Если переход не очень эффективен и одновременно видно зеленый и красный свет, то речь идет о промежуточном состоянии. Эта молекулярная линейка и используется для исследований.

Если между двумя молекулами вставить пружинку, сделанную из линкера — например, аминокислоты пролин и глицин, — то получится подобие зонда, который светится по-разному в зависимости от его растяжения. Если внедрить такую конструкцию в клетку, то при даче на вход системы синего цвета будет наблюдаться зеленый, красный или их смесь. В зависимости от цвета можно понять, растянут ли линкер и какого масштаба силы развивает эта конструкция в клетке.