Электронная микроскопия одиночных частиц

Одновременно с этим в нашей лаборатории молекулярной биологии при Совете по медицинским исследованиям в Кембридже проходили исследования устройства спирали и икосаэдрических вирусных частиц. Эти две исследовательские традиции можно считать началом области, которую мы называем электронной микроскопией в структурной биологии. Но к середине 1980-х годов, с развитием криоэлектронной микроскопии и последующими разработками методов заморозки Дюбоше, стало очевидно, что этот метод станет чрезвычайно влиятельным. У нас в лаборатории молекулярной биологии при Совете по медицинским исследованиям даже был студент по имени Гас Вигорс, который посещал курс Жака Дюбоше в Гейдельберге, в котором впервые началось обучение электронной микроскопии и методу быстрой заморозки. Вернувшись, он сказал: «За этим будущее. Я оставляю свой проект». И он прекратил работу над проектом, которым мы ему предложили. Я был одним из его методических руководителей. Около 1985 года он перешел к криоэлектронной микроскопии одиночных частиц.

Потом группа Дюбоше выпустила несколько статей о структуре аденовирусных частиц, о структуре частиц вируса леса Семлики. Другие исследователи из Европейской молекулярно-биологической лаборатории опубликовали криоэлектронно-микроскопические структуры концевых сегментов бактериофагов. Вигорс, один из студентов нашей лаборатории молекулярной биологии, открыл структуру клатриновых оболочек — белковых оболочек, окружающих пузырьки в процессе клеточной секреции. Но первые криоэлектронно-микроскопические структуры были существенно ограничены в разрешении: доступное разрешение в 40–50 ангстрем давало нечеткие структуры. Так что это не приблизило нас к атомным структурам, в которых виден каждый атом молекулы, а именно это, разумеется, является конечной целью структурной биологии — опознать атомную структуру всего в биологии.

Мой вклад в этот процесс заключался в использовании криомикроскопии для изучения структуры двухмерных кристаллов. В 1990 году нам удалось найти атомную структуру для бактериородопсина — белка, с которым мы долгое время работали и который формирует двухмерные кристаллы. Но и мне, и коллегам все стало довольно очевидно, и уже в 1995 году мы перешли от электронной кристаллографии — криоэлектронной микроскопии двухмерных кристаллов — к исследованию одиночных частиц. Таким образом, последние двадцать лет мы были сфокусированы на следующем вопросе: «Почему путем электронной микроскопии одиночных частиц не удалось открыть атомные структуры?» Причина в технических несовершенствах микроскопов. Микроскопы не были достаточно хороши, вакуумные установки были плохи, яркость источника была низкой, детекторы, измеряющие изображение, были пленочными, тоже недостаточно хорошими.

Постепенно, в течение последних двадцати лет, все технические ограничения микроскопов для электронной микроскопии были преодолены, было достигнуто улучшенное, эффективное соотношение «сигнал — шум». Поворотной точкой, наверное, стал 2012 год, когда выпустили новое поколение детекторов электронов. Они давали более качественные изображения, и эти изображения позволили задействовать все другие технологические улучшения электронных микроскопов. Их также удалось использовать для компьютерного 3D-моделирования структур. Здесь очевидно синергичное пересечение самых разных подходов. С 2012 года нам удалось получить структуры в высоком разрешении, тогда как до этого было доступно только низкое разрешение.

Теперь поле исследований, связанное с криомикроскопией, стало довольно популярным среди людей, которые раньше об этом не знали. Сегодня кто-то может сказать: «Знаешь, я пытаюсь определить эту белковую структуру уже десять лет, я изучал ее самыми разными способами, пытался кристаллизировать, но не преуспел: кристаллы либо не формируются, либо беспорядочно организуются, и я не могу увидеть структуру». И потом: «Возможно, стоит попробовать криоэлектронную микроскопию или просто криомикроскопию». И они пробуют: берут маленькое количество своего образца, буквально пару капель, размещают их на объектной сетке, применяют метод Дюбоше, при котором образец замораживается, исследуют его через электронный микроскоп, делают снимки, которые благодаря новым детекторам получаются цифровыми, вычисляют структуру — и за несколько дней у них в распоряжении оказывается структура, на поиск которой другими методами они потратили последние десять лет.

Люди, которые давно работают в этом направлении, могли предсказать такой поворот. Но успех оказался еще более значительным, чем мы ожидали. В итоге люди, у которых сейчас нет глубокой осведомленности обо всех процессах, могут прийти и выявить необходимые структуры, просто выполняя процедуру. В Америке это стало сродни золотой лихорадке, когда многие люди легко наживали состояния на золотых приисках. Сейчас есть профессионалы, которые отлично понимают, что они делают, люди, которые учатся и вникают, а также новички, вся система для которых кажется загадочным механизмом. Они готовят объектные сетки, делают снимки, следуют выработанной процедуре и видят необходимый результат — в этом и цель. Изначально именно такой была цель тех, кто определял последовательность ДНК: сделать это процесс таким легким и быстрым, чтобы он был доступен каждому.

Сегодня криоэлектронная микроскопия одиночных частиц очень успешна. Теперь нам открыты самые разнообразные структуры — от множества структур сложных вирусов (сотни миллионов дальтон) до малых внутриклеточных структур (например, рибосомы сплайсингосомы); от молекулярных механизмов, лежащих в основе всего живого, до белков, содержащихся в мембранах, которые переносят, например, молекулы аденозинтрифосфатазы, которые синтезируют все АТФ, вплоть до самых малых энзимов или рецепторов, которые участвуют в генерации и обращении нормальных клеток в раковые. Некоторые исследователи используют эти инструменты для получения аналитических данных о фундаментальных биологических процессах, влияющих на здоровье человека. Мне кажется, криоэлектронная микроскопия одиночных частиц сейчас становится одним из методов структурной биологии вообще.

Об актуальном статусе электронной криомикроскопии стоит сказать две вещи. Во-первых, многим этот метод кажется перспективным, и они пробуют включать его в свои исследования. Так, электронная криомикроскопия входит в спектр основных научных методов. Но это еще не конец, остается ряд преград, устранив которые мы можем сделать этот метод еще эффективнее. Допустим, те детекторы, которые у нас есть, хоть и превосходят по мощности пленочные, но все еще могут зафиксировать лишь около 50% электронов. Соотношение «сигнал — шум» тоже может быть улучшено на несколько показателей.

Существует проблема, которая беспокоит многих людей, но мало кто над ней работает: при попадании луча света на образец связи рушатся, электроны теряют порядок, образец заряжается, прямо во время съемки в нем начинаются изменения, из-за чего изображение размывается. Вызываемые светом движение и изменение заряда являются серьезной проблемой, но мы работаем над ней, потому что минимизация этого эффекта могла бы существенно повысить качество изображения. Другие исследователи работают над похожей проблемой в оптической микроскопии. Существует фазовая пластинка Цернике, которая создает сдвиг фазы в луч. У нас уже есть прототипы, которые можно применять в работе, но они сложны в использовании, так что использование фазовых пластинок может быть продуктивным. Электронные линзы в электронном микроскопе аналогичны всем неахроматическим линзам. Они напоминают оптические микроскопы XV века, которые использовались до изобретения ахроматической линзы, сводящей в одну точку синие и красные лучи.

Решив эту проблему, а также ряд других, связанных с приготовлением образцов, можно существенно расширить потенциал электронной криомикроскопии одиночных частиц. Все, кто работает в этой сфере, имеют очень позитивные ожидания на этот счет. Можно сказать, что этот метод ждет светлое будущее.

Нужно отметить один момент: многие структуры и многие проблемы в биологии уже довольно хорошо проанализированы и поняты. Конечно, новые методы — электронная криомикроскопия одиночных частиц, томография электронного облака и другие — внесут свой вклад в этот процесс. Однако есть вероятность того, что когда-то наступит конец структурной биологии как передового научного подхода, потому как в биологии количество структур ограничено. Например, в человеческом геноме содержится около 20 или 25 тысяч генов. Возможно, нам уже известны структуры половины этих молекул. Тогда через пять-десять лет мы приобретем довольно полное понимание трехмерных структур — не только последовательностей генов и белков, но и трехмерных структур всего в биологии. Произойдет сдвиг фронтира исследований, и структурная биология станет техникой, используемой для понимания биологии. Все еще останутся проблемы прояснения механизмов работы мозга, молекулярной базы сознания, все еще будут некоторые виды рака, которые необходимо изучить. Так, в будущем нас ждет еще много нерешенных проблем.

Мне самому кажется, что исследователь, сделав открытие и детально его описав, удовлетворив тем самым большинство людей, может продолжать изобретать. Несмотря на то, что количество возможных открытий в биологии ограничено, конечен и весь мир. Вселенная ограничена. А за ее пределами можно изобрести что угодно. Так что я считаю, что структурная биология, молекулярная биология, биология человека изменятся — закончится эра, в который ученые делают открытия, а не изобретают ничего, кроме исследовательских техник. Сейчас можно сказать, что соотношение изобретателей и исследователей — это примерно 75 на 25. Очень многие сегодня занимаются изобретением новых методов лечения (например, молекулярными антителами). Некоторые типы рака и определенные вирусы могут быть полностью вылечены. Эти изобретения были сделаны исключительно благодаря целенаправленной деятельности ученых, предпосылок для них не было в естественной среде. Думаю, что стоит ожидать постепенного перехода от открытий к изобретениям. А дальше ограничений нет, в будущем можно изобрести бесчисленное количество вещей.