Знакомьтесь: самая главная молекула

Она похожа на… штопор

План того, каким получится каждый из нас, готов в тот момент, когда половые клетки наших родителей, мамы и папы, сливаются в одно целое, называемое зиготой, или оплодотворенной яйцеклеткой. План заключен в ядре этой одной-единственной клетки, в ее молекулax ДНК, и в нем значится очень многое: и то, каким будет цвет наших глаз и волос, и насколько высоким будет рост, и какой формы нос, и насколько тонким — музыкальный слух и многое, многое другое. Конечно, наше будущее зависит не только от ДНК, но и просто от превратностей судьбы. Но очень, очень многое в нашей судьбе определяется качествами, заложенными от рождения, нашими генами, т. е. последовательностью нуклеотидов в молекулах ДНК.

ДНК удваивается при каждом делении клеток, так что каждая клетка несет в себе информацию о строении всего организма. Это как если бы в каждом кирпичике здания хранился миниатюрный план всего здания. Вот бы архитекторы с давних времен так поступали! Тогда реставраторам не пришлось бы ломать себе голову, скажем, над тем, как выглядел когда-то Пергамский алтарь, даже если бы от него сохранился один-единственный камень.

То, что специализированная клетка целого организма на самом деле знает, как устроен весь организм, было впервые продемонстрировано в конце 1950-х годов британским биологом Джоном Гёрдоном. Он брал ядро клетки из взрослой лягушки и, используя тончайшую микрохирургическую технику, пересаживал его в лягушачью икринку, в которой собственное ядро было убито ультрафиолетовым облучением. Из гибридной икринки вырастал нормальный головастик или даже лягушка — абсолютно идентичная той, чье клеточное ядро было взято. Природа сама иногда создает таких двойников. Это получается, когда после первого деления зиготы дочерние клетки не остаются вместе, а расходятся, и из каждой получается свой организм. Так рождаются однояйцовые, или идентичные, близнецы. У близнецов совершенно одинаковые молекулы ДНК, поэтому они так похожи. В самом конце прошлого века британским зоологам удалось применить методику Гёрдона к млекопитающим: началась эра клонирования. Первой методом клонирования была успешно получена овца по имени Долли, ставшая настоящей знаменитостью. ДНК для Долли была взята в виде клеточного ядра, изъятого из вымени некой овцы, которая не дожила до рождения своего двойника. Это ядро было пересажено в яйцеклетку, извлеченную из другой овцы, из которой (яйцеклетки) свое ядро было удалено. Затем такую гибридную клетку, несущую чужое ядро, поместили назад, откуда ее извлекли. В результате и родилась Долли, полная копия той овцы, которая поставила ДНК. Долли прожила шесть лет и скончалась. Тем временем были получены клоны многих других животных, и время от времени мир облетает новость о клонировании человека. Но пока ни одно из этих сверхсенсационных сообщений (о клонировании человека) не подтвердилось, да и исходили эти сообщения от явных шарлатанов.

Так или иначе, успех опытов по клонированию не оставляет ни малейших сомнений в том, что ДНК ядра полностью определяет то, кто получится в ходе развития организма из одной-единственной клетки. Мы продолжим обсуждение клонирования и смежной темы репрограммирования клеток в главе 11.

Как же устроена молекула ДНК, эта королева живой клетки? Она вовсе не простая веревочная лестница, как можно подумать, глядя на рис. 4. Эта лестница завита в правую спираль. Она напоминает штопор, но штопор двойной; такие редко, но встречаются. Каждая из нитей ДНК образует правую винтовую линию, точь-в-точь как на штопоре (рис. 8). Азотистые основания четырех типов, в последовательности которых и заключена генетическая информация, образуют как бы начинку этого штопорообразного кабеля. На поверхности кабеля располагается сахаро-фосфатный остов полимерных цепей, из которых состоит ДНК.

Мономерные звенья, из которых строится ДНК, очень похожи на мономерные звенья РНК, химическое строение которых показано на рис. 6. Мы не будем поэтому снова рисовать все четыре нуклеотида, покажем только, как выглядит нуклеотид Т (рис. 9), который больше всего отличается от своего РНКового аналога — У. Отметим, что верхнее кольцо называется азотистым основанием, пятичленное кольцо — сахаром, а слева расположена фосфатная группа.

Каковы главные размеры ДНК? Диаметр двойной спирали 2 нм, расстояние между соседними парами оснований вдоль спирали — 0,34 нм. Полный оборот двойная спираль делает через 10 пар. Ну, а длина? Длина зависит от того, какому организму ДНК принадлежит. ДНК простейших вирусов содержит всего несколько тысяч звеньев, бактерий — несколько миллионов, а высших — миллиарды.

Если выстроить в одну линию все молекулы ДНК, заключенные лишь в одной клетке человека, то получится нить длиной около 2 м. Следовательно, длина этой нити в миллиард раз больше ее толщины. Чтобы лучше представить себе, что это значит, вообразите, будто ДНК на самом деле вдвое толще, чем на рис. 8, — около 4 см. Такой ДНК, взятой всего из одной клетки человека, можно было бы опоясать земной шар по экватору. В этом масштабе клеточное ядро имеет размеры стадиона, а человек — это уже земной шар.

Ясно, что одна из весьма серьезных проблем, особенно в многоклеточных организмах, где молекулы ДНК очень длинные, это укладка молекулы, чтобы она поместилась в клеточном ядре. Уложить-то ее надо так, чтобы ДНК была доступной по всей длине для белков, например для РНК-полимеразы, считывающей нужные гены. Другая проблема — репликация столь длинных молекул. Ведь после удвоения ДНК две комплементарные цепи, которые первоначально были многократно закручены одна относительно другой, должны оказаться разведенными. Это значит, что молекула должна прокрутиться вокруг своей оси миллионы раз, прежде чем закончится репликация. Из этого следует, что вопросы, порожденные работой Уотсона и Крика, отнюдь не ограничивались проблемой генетического кода и связанными с ней вещами.

Эти вопросы порождали и сомнения. А верна ли модель Уотсона–Крика? Насколько надежен тот фундамент, на котором строятся все данные молекулярной биологии? Модель Уотсона–Крика была столь конкретна, столь детализирована, что прямо-таки дразнила своей уязвимостью. Достаточно было найти хотя бы один четкий факт, противоречащий ей, чтобы двойная спираль оказалась сброшенной с пьедестала. Это была задача для физиков, и они принялись за работу.

Если каждая молекула ДНК действительно состоит из двух полимерных цепочек, рассуждали одни, и эти цепочки связаны друг с другом слабыми нековалентными силами, то они должны расходиться при нагревании раствора ДНК, что можно четко зафиксировать в опыте. Если азотистые основания в ДНК действительно образуют друг с другом водородные связи, рассуждали другие, то это можно проверить, измеряя спектры ДНК в инфракрасной области или исследуя скорость обмена обычного (легкого) водорода на тяжелый (дейтерий). Если внутри двойной спирали и впрямь запрятаны азотистые основания, рассуждали третьи, то можно выяснить, действуют ли на ДНК те вещества, которые способны реагировать только с этими, запрятанными группами. И эти, и многие другие опыты были поставлены. К концу 1950-х годов стало ясно — модель выдержала первое испытание. Попытки опровергнуть ее терпели неудачу одна за другой.

Она похожа на оконное стекло

Физики занялись изучением ДНК не только потому, что понимали важность проверки всех деталей ее структуры. Молекула ДНК привлекла их внимание и сама по себе.

В книге Э. Шрёдингера «Что такое жизнь?» есть слова (они взяты эпиграфом к этой главе), оказавшиеся пророческими. ДНК действительно похожа на твердое тело. Пары оснований уложены в ней как в кристалле. Но это кристалл линейный, как бы одномерный — каждая пара оснований имеет только двух соседей. Кристалл ДНК — апериодический, так как последовательность пар оснований нерегулярна, как нерегулярна последовательность букв в осмысленном тексте книги. Но подобно буквам в печатном шрифте, пары оснований А•Т и Г•Ц имеют одинаковые размеры как в ширину, так и в высоту.

Конечно же, кристалл совершенно нового типа, одномерный кристалл ДНК, страшно заинтриговал физиков. Не полупроводник ли он? А может быть, сверхпроводник, да еще при комнатной температуре? ДНК была подвергнута очередному обследованию. Нет, она не полупроводник и уж подавно не сверхпроводник. Она оказалась обыкновенным изолятором, вроде оконного стекла. Да она и прозрачна, как стекло. Водный раствор ДНК (а в воде она растворяется очень хорошо) просто прозрачная жидкость. Этим сходство со стеклом не заканчивается. Обычное стекло, в том числе и оконное, прозрачно для видимого света и очень сильно поглощает ультрафиолетовые лучи. ДНК тоже поглощает в этой части спектра. Но в отличие от стекла, которому ультрафиолетовые лучи не вредны, ДНК к ним очень чувствительна.

Ультрафиолетовые лучи настолько губительны для молекулы ДНК, что клетка выработала в ходе эволюции специальную репарирующую систему, которая залечивает повреждения, нанесенные этими лучами. Что же это за повреждения?

Когда квант ультрафиолетового излучения (фотон) попадает в ДНК, то он передает свою энергию азотистому основанию. Основание оказывается в возбужденном состоянии. Далее события могут развернуться по-разному. Если фотон поглощен пурином (аденином или гуанином), то ничего особенного не произойдет — поглощенная энергия быстро превратится в тепло (как это бывает в оконном стекле), а ДНК останется такой же, какой была. Другое дело, если фотон поглотится пиримидином (тимином или цитозином), причем не любым, а тем, который соседствует в цепи с другим пиримидином. В этом случае поглощенная энергия не успевает еще превратиться в тепло, как два соседних пиримидина вступают в химическую реакцию. Этот процесс особенно эффективен, если по соседству оказываются два тимина. Результат — новое химическое соединение, называемое фотодимером тимина ТТ (рис. 10).

Строение димера довольно необычно. В самом деле, углерод обыкновенно бывает либо тетраэдрическим, когда его связи с соседними атомами идут из центра тетраэдра в его вершины, либо треугольным, когда связи лежат в одной плоскости и направлены из центра в вершины правильного треугольника. Но в фотодимере две связи у каждого атома углерода, участвующего в сцеплении тиминов, образуют прямой угол! А все четыре атома углерода образуют квадрат (он носит название циклобутана).

Итак, в ДНК возникло повреждение — вместо двух тиминов образовалось совершенно новое химическое соединение, дойдя до которого ферменты, работающие на ДНК, остановятся. Они знают только четыре буквы: А, Т, Г и Ц, а тут какой-то новый значок ТТ. Им он не известен. Если эту помарку не выправить, не убрать из текста, то ферменты не смогут ни снять с ДНК копию, ни считать с нее информацию (синтезировать РНК). Вся жизнь клетки остановится, и она погибнет.

Ультрафиолетовые лучи представляют столь серьезную угрозу для молекулы ДНК, что в ходе эволюции клетка выработала специальную систему, чтобы бороться с повреждениями ДНК, вызванные этим излучением. Ферменты этой репарирующей системы приходят на помощь. Сначала фермент УФ-эндонуклеаза узнает тиминовый димер и рвет в этом месте сахарофосфатную цепь. Далее фермент экзонуклеаза расширяет возникший разрыв. В одной из нитей ДНК, там, где образовался тиминовый димер, получается огромная брешь — в несколько тысяч нуклеотидов. При этом оказываются удаленными не только тиминовый димер, но и масса нормальных нуклеотидов, как говорится, на всякий случай. Но это не беда — другая, комплементарная нить остается целой, и по ней специальный фермент, ДНК-полимераза I, надстраивает вторую нить, создавая нормальную двойную спираль, идентичную исходной, неповрежденной ДНК.

Так вот, оказывается, в чем смысл двунитчатости ДНК! Она нужна не только для создания двух идентичных копий генетического материала, но и для того, чтобы информацию, заключенную в ДНК, можно было уберечь от повреждений. Если бы между циклами удвоения ДНК была однонитевой, то ее невозможно было бы починить.

Репарирующие системы есть во всех клетках, от простейших до человека. Это неудивительно — жизнь зародилась под Солнцем. Может показаться странным, что репарирующая система активна даже в таких клетках, которые никогда не испытывают действия солнечного излучения — например, клетки кишечника. Остроумное объяснение этому предложил Г. М. Баренбойм. Он предположил, что ДНК защищается от излучения Вавилова–Черенкова, возникающего в клетках при распаде естественной примеси радиоактивных элементов.

Если же в результате мутации репарирующая система выйдет из строя — это настоящее бедствие. Иногда рождаются дети с дефектом, который называется ксеродерма пигментозум. Они совершенно не могут быть на свету — их кожа покрывается язвами, которые постепенно переходят в злокачественные опухоли. Таких детей не удается спасти, даже тщательно оберегая их от солнца. Вообще, прямыми опытами на животных показано, что тиминовые димеры могут вызывать рак.

Выходит, загорать — это действительно совсем не невинное занятие. Конечно, мы не можем отказать себе в этом удовольствии, но не следует перегружать репарирующую систему. Кроме того, репарация — не вполне безобидная вещь. Считают, что ферменты репарирующей системы, в особенности ДНК-полимераза I, склонны допускать ошибки, так что репарация может приводить к мутациям. А соматические мутации (т. е. происходящие в неполовых клетках тела) также рассматриваются в качестве важного фактора, приводящего к злокачественному перерождению ткани (см. главу 11).

Вот сколько хлопот от того, что ДНК чувствительна к ультрафиолетовым лучам. А ведь эти лучи едва достигают поверхности Земли, основная их часть поглощается в атмосфере. Так что стоит ли сожалеть, что ДНК прозрачна, как оконное стекло, в отношении видимой части спектра?

Она плавится, но не так, как лед

И все-таки те, кто ждал от молекулы ДНК необычных физических свойств, были вознаграждены. Одномерность и апериодичность кристалла ДНК в полной мере проявляются при его плавлении. Но если кристаллическое состояние ДНК — это понятно, что такое, то как представить его переход в жидкое? Во что может превратиться одномерный кристалл ДНК при плавлении? Чтобы разобраться в этом, вспомним, почему плавится лед.

Лед представляет собой кристалл, построенный из молекул Н2О. В нем царит строгий порядок, при котором молекулы воды связаны друг с другом максимально возможным числом так называемых водородных связей (Н-связей): HO-H … OH2. Это те самые Н-связи, которые образуются в комплементарных парах оснований А•Т и Г•Ц (см. главу 9). Некоторые из этих связей рвутся, другие деформируются при переходе воды в жидкое состояние. Что же заставляет воду быть жидкой при температуре выше нуля по Цельсию? Потеряв часть из связей, ослабив другие, молекулы воды приобретают возможность гораздо свободнее двигаться (перемещаться и вращаться), что становится очень выгодным с ростом температуры. При еще большем нагревании молекулы воды ради полной свободы жертвуют последними связями друг с другом — происходит переход из жидкого в газообразное состояние. Это общая тенденция. С ростом температуры вещества проявляют готовность пожертвовать энергией связи между молекулами ради увеличения энтропии.

Все это в полной мере относится и к ДНК — с ростом температуры существование двойной спирали становится невыгодным. Межмолекулярные связи, Н-связи внутри пар оснований и так называемые стэкинг-взаимодействия между соседними вдоль цепи парами, удерживающие две комплементарные цепи друг около друга, рвутся, и из одной двунитевой молекулы образуется две однонитевые цепи (рис. 11). Энтропийно (т. е. в смысле получения большей свободы) это выгодно потому, что, не будучи связанной с комплементарным партнером, каждая цепь чувствует себя гораздо свободнее, может приобретать намного больше различных конфигураций в пространстве.

Сами нити ДНК порвать простым нагреванием нельзя — связи, соединяющие нуклеотиды в цепочку, настолько прочны, что их можно разрушить либо сильной кислотой, либо порезать ферментами нуклеазами.

Несмотря на аналогию, плавление ДНК принципиально отличается от плавления льда. Отличие состоит в том, что плавление ДНК происходит в широком интервале температур; этот интервал равен нескольким градусам, а плавление льда происходит строго в одной точке на шкале температур. Это так называемый фазовый переход. При таком переходе скачкообразно изменяется фазовое состояние вещества — из твердого оно становится жидким, из жидкого — газообразным.

Мы каждый день сталкиваемся с фазовым переходом, когда кипятим чайник. В процессе кипения система вода–пар находится в самой точке фазового перехода — температура чайника ни на йоту не превысит 100 °С, пока не выкипит вся вода. То же самое будет происходить при нагревании льда или снега. Температура растет до 0 °С, потом рост прекратится, пока весь лед полностью не растает, а затем температура вновь пойдет вверх. В отличие от фазовых систем, у ДНК температура растет непрерывно, и с ее повышением все новые участки молекул переходят из спирального состояния в расплавленное. Интересно, что это отличие — прямое следствие одномерности кристалла ДНК. Осознавать, что такое поведение вещества возможно, физики начали еще до Второй мировой войны, когда и не думали о ДНК или о реальных одномерных кристаллах. Просто никак не удавалось построить полную теорию фазовых переходов в настоящих трехмерных кристаллах (это получилось лишь гораздо позже — в 1970-х годах), и возникла мысль, что, может быть, удастся это сделать хотя бы для одномерного или двумерного кристалла.

Проанализировать первый вариант оказалось совсем просто. Но вот беда — никакого фазового перехода не получалось. Глубокий смысл этой неудачи был понят знаменитым советским физиком Львом Давидовичем Ландау (мы уже упоминали его имя в начале главы 2). Вот что он писал (вместе с Е. М. Лифшицем) в 1938 году: «Во всякой одномерной системе не может существовать фаз, так как они стремились бы перемешиваться друг с другом». Это утверждение, известное во всем мире как «теорема Ландау», долгое время считалось чисто негативным, означающим только, что одномерная система — никуда не годная модель для теоретического рассмотрения проблемы фазовых переходов.

Вряд ли Ландау думал, что когда-нибудь найдутся реальные системы, к которым удастся применить его утверждение. Но ДНК — это действительно почти такая система. Слово «почти» здесь поставлено потому, что теорема Ландау была доказана для строго однородных систем, а ДНК, как мы помним, — апериодический кристалл. Его составляют два сорта звеньев — пары А•Т и Г•Ц, отличающиеся силой связи. Пару А•Т легче порвать, чем пару Г•Ц. Поэтому ДНК, которая содержит больше пар А•Т, плавится при более низкой температуре.

Важно ли то, сколько типов пар — два или один, как в строго однородном кристалле? Да, важно. Это очень интересный вопрос, и его исследовали многие теоретики уже прямо в связи с проблемой плавления ДНК. Прежде всего следует отметить работы М. Азбеля, А. Веденова, А. Дыхне, Д. Крозерса, И. Лифшица, Э. Монтролла, Д. Поланда. Много занимался данной проблемой и автор этих строк.

Что же оказалось? Вывод, сделанный Л. Д. Ландау, остается в силе. И в апериодической ДНК фазового перехода быть не может. Принципиально это также объясняется одномерностью системы, но происходит по иной причине, чем в строго однородном кристалле. Фазы отсутствуют не потому, что они стремились бы перемешиваться, как говорил Ландау, а потому, что участки ДНК, обогащенные парами А•Т, плавятся при более низкой температуре, чем участки, обогащенные парами Г•Ц. Поэтому переход в новое состояние происходит с ростом температуры не скачком, а поэтапно, участок за участком.

Если мерить зависимость поглощения тепла от температуры для раствора молекул ДНК, то на графике, отражающем эту зависимость, вместо одного бесконечно узкого пика, который характерен для плавления льда, мы должны наблюдать множество пиков, отвечающих выплавлению отдельных участков в молекуле. Ширина каждого пика, как предсказывает теория, должна соответствовать примерно 0,5 °С. Эксперимент полностью подтвердил это предсказание. На рис. 12 видно, как идет поэтапное плавление ДНК (плазмиды СоlЕ1), содержащей около 6500 пар оснований.

Конечно, никто не может измерить теплопоглощение одной-единственной молекулы. Экспериментатор обычно имеет дело с образцом, состоящим из миллиардов и миллиардов молекул, но у всех у них строго одинаковая последовательность нуклеотидов. И при той или иной температуре во всех молекулах раскрываются одни и те же участки. Поэтому, исследуя эффект на множестве одинаковых молекул, можно судить о том, что происходит с каждой из них в отдельности.

Сотрудникам Института молекулярной генетики РАН в Москве (А. Боровик с соавторами) удалось буквально воочию наблюдать поэтапное плавление ДНК. Они научились фиксировать раскрытые участки в молекуле с помощью специально подобранного химического агента. Обработанные препараты изучались под электронным микроскопом. Опыт шел так. Раствор ДНК нагревали до определенной температуры, попадающей в интервал плавления. При этом раскрывались отдельные участки молекулы (цепи в этих местах расходились, и азотистые основания оказывались торчащими наружу). Затем в раствор добавляли вещество, реагирующее с раскрытыми основаниями, но неспособное связываться с основаниями, запрятанными внутри двойной спирали. Когда реакция заканчивалась, образец охлаждали до комнатной температуры — прореагировавшие участки уже не могли вновь закрыться и образовать двойную спираль.

Обработанные таким образом молекулы ДНК исследовали под электронным микроскопом. Один из полученных электронно-микроскопических снимков показан на рис. 13. Получив множество снимков молекул, раскрытых при разных температурах, построили результирующую картину (рис. 14). По горизонтальной оси здесь отложена координата пары оснований вдоль цепи ДНК. По вертикальной оси — вероятность того, что данная пара раскрыта, а по третьей оси — температура. Сравнение с кривой зависимости теплопоглощения от температуры (слева вверху на рис. 14) показывает, что каждому пику действительно соответствует выплавление определенного участка ДНК. Рисунок позволяет определить, какой вид имеет молекула ДНК при любой температуре в интервале плавления. Например, видно, что при 72 °С в молекуле должны быть расплавлены оба конца, а также участок, отстоящий от левого конца на 80% общей длины молекулы. Это как раз отвечает снимку, приведенному на рис. 13. Отметим, что в ДНК вовсе не всегда плавление начинается с концов, как в данном случае. Просто у этой молекулы на обоих концах расположены участки, сильно обогащенные парами А•Т.

Да, изучать плавление ДНК оказалось гораздо более интересным делом, чем плавить лед. Вместо одного пика, у которого ширину-то не измерить, — множество пиков, положение и ширина которых определяются последовательностью нуклеотидов в ДНК. Каждая молекула ДНК имеет свой, характерный «профиль» плавления, в зависимости от хранящейся в ней генетической информации.

Но плавление ДНК — это не просто уникальное физическое явление. Это процесс, который постоянно происходит в клетке. В самом деле, и при удвоении ДНК, и при считывании с нее информации комплементарные цепи должны быть разведены, чтобы на каждой из них (в случае репликации) или на одной из них (в случае транскрипции) начался синтез цепей ДНК или РНК.

Как же разводятся цепи? Что играет роль утюга, способного расплавить участок ДНК? Эту роль играют специальные ферменты, в частности РНК-полимераза. Фермент прочно связывается с ДНК и расплетает ее, но не любой участок молекулы, а определенную последовательность нуклеотидов, промотор, расположенную между генами. После того как РНК-полимераза связалась с промотором и расплавила его (раскрывается около десяти нуклеотидов), она начинает двигаться вдоль гена, расплетая на своем пути все новые участки и ведя синтез молекулы мРНК. Те участки гена, с которых полимераза «съехала», вновь захлопываются, а синтезируемая молекула РНК свешивается в раствор. К ней подплывает рибосома и начинает синтез белка по законам генетического кода. Все это схематически показано на рис. 15.

Но мы забежали вперед. Нам еще предстоит рассказать о рождении генной инженерии, заложившей основу биотехнологии, о ее потрясающих достижениях и захватывающих дух перспективах в последующих главах, в особенности в главе 10. А пока продолжим знакомство с самой молекулой ДНК.