Нобелевская премия по химии в 2018 году присуждена ученым Фрэнсис Арнольд «за направленную эволюцию ферментов» и Джорджу Смиту и Грегори Винтеру «за фаговый дисплей антител и пептидов». Доктор биологических наук Сергей Тиллиб рассказывает о технологии фагового дисплея.

Направленная эволюция ферментов

Направленная эволюция ферментов — это комплекс лабораторных процедур с целью ускорить эволюционный процесс изменения и отбора молекул (в данном случае ферментов) с улучшенными, желаемыми и новыми свойствами. Сначала выбираются исходные, наиболее подходящие белковые молекулы, затем в кодирующую их последовательность ДНК вводятся продуманные или случайные изменения. Полученные последовательности / модифицированные белки анализируются: из них отбираются наилучшие варианты. Затем процедура искусственного мутагенеза повторяется для уже отобранных вариантов молекул, и из них вновь отбираются самые подходящие — и так до тех пор, пока не будут получены варианты молекул ферментов с желаемыми свойствами: например, повышенной ферментативной активностью, активностью в отношении новых субстратов, способностью катализировать новые химические реакции или уже известные реакции, но в новых, необычных условиях.

Фрэнсис Арнольд является одним из пионеров направленной эволюции ферментов. Начиная с 1990-х годов она разработала много новых методических подходов в этом направлении и сумела получить ряд новых эффективных ферментов для различных каталитических процессов (не загрязняющих окружающую среду), используемых в химической и биотехнической индустрии.

Рекомендуем по этой теме:
8947
Войны бактерий и фагов

Технология фагового дисплея

Технология фагового дисплея — это очень эффективный метод для проведения массового параллельного анализа и отбора наиболее перспективных вариантов белков, пептидов или рекомбинантных антител, специфически связывающих определенную мишень. Одновременно с этим функциональным отбором определяют и ДНК, кодирующую эти связывающие белки. На основе кодирующей ДНК затем получают клетки-продуценты соответствующих белков с искомыми свойствами.

Сейчас эта эффективная технология активно используется практически во всех биотехнологических компаниях для создания новых поколений диагностических и иммунотерапевтических препаратов.

Первым разрешенным для медицинского применения (в 2002 году) гуманизированным терапевтическим антителом, полученным с помощью фагового дисплея (в компании, основанной Грегори Винтером), является адалимумаб (Adalimumab, HUMIRA). Он был утвержден в 2002 году. Адалимумаб связывает секретируемый провоспалительный цитокин TNF-α, и его используют при лечении ревматоидного артрита, псориаза и ряда других заболеваний. В 2017 году это лекарство было наиболее продаваемым фармпрепаратом: оно было продано на сумму свыше 18 миллиардов долларов.

Ряд других подобных терапевтических антител, получаемых с помощью метода фагового дисплея и разрабатываемых для лечения различных социально значимых заболеваний человека, находятся на разных стадиях клинических испытаний. Фаговый дисплей может быть также использован для определения связываемого [tooltip word="эпитопа» text="часть молекулы антигена, которую может распознать иммунная система"] для заданного антитела.

Фаговый дисплей основан на принципе физического соединения гена и кодируемого полипептида в одной фаговой / вирусной частице, а также на специфическом аффинном обогащении. В ходе обогащения полипептид (на поверхности фага) связывается с заданной мишенью. Затем следует амплификация — размножение в бактериальной культуре фагов, которые несут в составе белка на своей поверхности встроенный чужеродный полипептид с требуемыми для специфического связывания свойствами.

Эта технология, получившая основное развитие в 1990-х годах, была впервые продемонстрирована Джорджем Смитом в 1985 году. Он показал связь между генотипом и фенотипом в нитчатом бактериофаге. Идея основана на двух принципах. Во-первых, фаг, инфицирующий бактерию, демонстрирует связь свойств белка с кодирующей его ДНК: белок, экспонированный на поверхности фага, и ген, его кодирующий, объединены [tooltip word="вирионом» text="вирусная частица, состоящая из нуклеиновой кислоты и белковой оболочки и находящаяся вне живой клетки"]. Во-вторых, библиотеки ДНК-последовательностей, содержащие миллиарды вариантов, могут быть упакованы в фаговых частицах, и индивидуальные частицы можно отобрать благодаря взаимодействию экспонированного на поверхности белка с заданной парой.

Результатом селекции с помощью метода фагового дисплея является специфически обогащенная библиотека фагов, на поверхности которых находятся полипептиды, способные связываться с заданным полипептидом или иным антигеном. Внутри вириона находится ДНК, которая кодирует полипептиды, экспонируемые на поверхности. Эти ДНК-последовательности, обогащенные согласно свойствам кодируемых полипептидов, и являются целью селекции. С их помощью можно наработать соответствующий кодируемый полипептид в различных системах экспрессии. После отбора клонов фагов проводится анализ ДНК, чтобы выявить идентичные и различающиеся варианты для их группирования и последующего использования. Последовательности ДНК используются для наработки и дальнейшего анализа соответствующих кодируемых полипептидов.

Рекомендуем по этой теме:
16025
Химиотерапия

Роль Джона Смита и Грегори Винтера в разработке фагового дисплея

Джордж Смит первым описал и продемонстрировал метод фагового дисплея. Он работал в основном с пептидными библиотеками. Смит показал, что фрагмент чужеродной ДНК можно встроить в ген III нитчатого фага, кодирующий поверхностный белок pIII, чтобы получить смешанный белок, несущий чужеродную последовательность. Смешанный белок включается в структуру вириона, который сохраняет инфекционность. Белок на его поверхности представлен в форме, доступной для распознавания специфическими антителами. Селекция проводилась на иммобилизированных антителах и позволила отобрать из «пептидных библиотек» фаги с экспонированными на поверхности (в составе рIII) полипептидами, которые специфически узнаются и связываются антителами.

С именем сэра Грегори Винтера связывают дальнейшую разработку этого метода для анализа библиотек антигенсвязывающих фрагментов антител. В 1990 году он опубликовал статью, в которой продемонстрировал возможность использования фагового дисплея для экспонирования в составе поверхностного белка фага одноцепочечных вариабельных фрагментов, получаемых методами генной инженерии на основе вариабельных частей тяжелой и легкой цепи антитела, соединенных полипептидным линкером. В этой же статье он написал о функциональной селекции кодирующих последовательностей вариантов тех фрагментов, которые связываются с антигеном. Позднее Винтер предложил ряд модификаций этого метода, в том числе использование в фаговом дисплее полностью синтетических библиотек антигенсвязывающих молекул.

Белки в составе фагов

Для сохранения жизнеспособности фага важно, чтобы белок продолжал функционировать в его составе: вирусная частица должна сохранять целостность, уметь заражать бактериальные клетки, а также содержать все необходимые компоненты и гены, необходимые для формирования новых зрелых вирусных частиц при размножении в клетках.

Помимо фагового дисплея, существуют и используются и другие дисплейные технологии: клеточный (или дрожжевой) дисплей, рибосомный дисплей, мРНК или ДНК-дисплеи. Однако бактериофаги используются наиболее часто, так как это надежный, высокоэффективный и относительно простой, экономичный и доступный метод селекции. Все дисплейные платформы основаны на возможности физического соединения полипептида, который производится клоном библиотеки, с соответствующим ему генотипом. Это позволяет определить кодирующую ДНК, содержащуюся в отобранном клоне, на основе связывания полипептида с определенной мишенью.

Рекомендуем по этой теме:
6871
Молекулярные машины

В зависимости от специфики полипептида библиотеки могут быть сконструированы таким образом, что все копии белка оболочки бактериофага или же только часть из них будут содержать вставку. В первом варианте ДНК-последовательность напрямую клонируется в геном фага. Второй вариант требует наличия фагмидной копии белка-партнера. Фагмиды — это кольцевые ДНК, гибриды между фагом и плазмидой, тоже кольцевой ДНК, которая автономно размножается (реплицируется) в бактериях. Они, в отличие от плазмиды, способны упаковываться в вирион.

Фагмида, внедренная в клетку бактерии вместе с фагом-помощником, на равных конкурирует с кольцевой ДНК фага за вхождение в формирующийся вирион. Антигенсвязывающие фрагменты антител обычно получают исходно в составе фагмидных библиотек, а затем их переводят в состав фаговых частиц, трансформируя бактериальные клетки и добавляя к ним фаг-помощник.

Этот фаг связывается в лунке иммунологического планшета с заданным полипептидом (аффинной парой). Несвязавшиеся или слабо связавшиеся фаги тщательно смываются. Для уменьшения неспецифических взаимодействий лунки с пептидом предварительно блокируются. Для этого используются большие концентрации белков, таких как сывороточный альбумин или казеин, которые не влияют на специфическое связывание. Селекция представляет собой баланс между позитивными факторами селекции, такими как специфичность и аффинность, и негативными факторами (токсичность для бактерии-хозяина, затрудненная слабая экспрессия, плохая растворимость получаемого белка).