Как у млекопитающих вроде нас с вами, так и у более простых позвоночных, таких как рыбки данио-рерио, которых мы используем как объект наших экспериментов, существует одна проблема: есть много нейронов, неспособных к регенерации. Если они оказываются повреждены, они могут выжить, но останутся дефектными. И многие виды повреждений, по сути, блокируют сообщение между мозгом и таким нейроном. Причина отсутствия регенерации состоит в том, что эти нейроны практически неспособны заново вырастить аксоны и дендриты.

Многие годы исследования в этой области проводились, и было обнаружено, что существует внутриклеточный процесс, в котором активнейшее участие принимает вторичный посредник, носящий название циклического аденозинмонофосфата (цАМФ). Этот посредник способен заново запускать рост аксонов нейронов, до того неспособных к регенерации.

Недостатком технических способов, при помощи которых пытаются повысить уровень цАМФ в клетках, является то, что они в основном фармакологические, и при таком подходе у вас очень мало возможности управлять тем, где ваше средство будет действовать, а где — нет. Так что вы, с одной стороны, способствуете регенерации, а с другой — изменяете нервные цепи на системном уровне, и этот процесс вам неподконтролен.

Нам же удалось разработать метод, с помощью которого мы можем воздействовать только на конкретные, нужные нам клетки при помощи света и тем самым повышать уровень цАМФ в них тогда, когда нам нужно, и настолько долго, насколько нам нужно. Так что этот метод открывает перед нами много возможностей. Инструментарий, который в нем задействован, носит название оптогенетики.

Метод исследований

Мы используем одни и те же технологии и в фундаментальном, и в прикладном аспекте нашей работы. Центральными для нашей работы являются молекулярная генетика, оптогенетика и микроскопия живых клеток. Мы используем подходы, позволяющие нам изменять поведение клеток на генетическом уровне, и визуализируем структуру органов чувств и сенсорных систем. Мы используем стандартные современные устройства, такие как спиннинг-диск конфокальная микроскопия, равно как и новые технологии, такие как технология «светового листа», оптоакустика и другие.

Как работает оптогенетика?

Мы используем факт, что для многих организмов свет — это очень насыщенный источник информации. В частности, у бактерий в процессе эволюции появились ферменты, реагирующие на свет. Существует одна почвенная бактерия, фермент аденилатциклаза которой реагирует на синий свет. Это совершенно естественный фермент, не претерпевший никаких генетических модификаций с нашей стороны. И мы подумали, что если мы можем сделать нейроны, производящие этот бактериальный тип аденилатциклазы — фермента, производящего цАМФ, то мы, вероятно, также сможем использовать свет, чтобы его активировать. И мы сделали вот что: мы создали кодон-оптимизированную версию аденилатциклазы, активируемой голубым светом, — bPAC, что позволило этому ферменту производиться эукариотами, в то время как изначально bPAC — это прокариотический фермент. И сначала мы сделали так, что этот фермент производился во всей рыбе. Затем мы посветили на них синим светом и обнаружили, что нам удалось повысить уровень цАМФ системно в организме рыбы.

Потом мы сделали так, чтобы фермент производился только в нейронах, наносили повреждения их аксонам, после чего брали ультрафиолетовый лазер, светили на рыбок и смотрели на их способность к регенерации. Если рыбы содержались в темноте, то есть на них не попадало никакого синего света, регенерировалось только около 5% аксонов, однако, если мы светили на них синим светом, это число увеличивалось в 6 раз.

Прикладное применение

Оптогенетика в целом уже определенное время применяется в прикладных науках, однако наше исследование является первой публикацией, показывающей, что эта технология может позволить «включить» регенерацию в нейронах, которые в обычных условиях на это не способны. Оптогенетику используют для повышения уровня цАМФ — уже было показано, что это работает в культурах клеток млекопитающих, в плодовых мушках — также на уровне целого организма — червя C.elegans. В целом это было проверено на нескольких системах, однако наша разработка пока что была использована только на рыбах и в фундаментально-научных целях.

Помимо исследований нервной системы, были работы в области стволовых клеток, метаболизма и других. Более того, некоторые работы в области биохимии также использовали оптогенетику, так что этот подход используется не только в нейронауках.

К примеру, были исследования по применению оптогенетики в клеточной терапии при болезни Паркинсона. Существует группа в Онкологическом центре Memorial Sloan-Kettering в Нью-Йорке, которая достигла некоторых успехов в лечении болезни Паркинсона у мышей с применением комбинации стволовых клеток, клеточной терапии и оптогенетики.

Суть этой работы в том, чтобы получить способность управлять требуемым биологическим процессом, будь то функционирование нейронов или в целом клеток, — их миграцией, пролиферацией или чем-то другим. Это можно сделать целиком в животном, и в этом главное преимущество оптогенетики. В целом это по сути то же самое, что и с нейронами. Все рассчитано на возможность активировать или деактивировать тот или иной биологический процесс при помощи света. Что это за процесс, что это за клетка, где она находится и другие вопросы такого рода значения не имеют. То, что работает в случае одной клетки, будет работать и с другими.

Открытые вопросы

Одна из существующих проблем состоит в том, что при ней все еще необходим трансгенез. То есть применение этой технологии в клинике столкнется с техническими и этическими проблемами: как заставить чужеродные гены экспрессироваться у пациента и стоит ли нам вообще это делать? Это та же проблема, что существует и у генной терапии. Это первая проблема. Вторая проблема состоит в том, что наиболее эффективное средство, способствующее регенерации, — bPAC — лучше всего активируется синим светом, однако большое количество синего света наносит вред тканям. А в дополнение к этому в биологических тканях синий свет сильно рассеивается, а это значит, что он не может пройти сквозь них так, как нужно. В идеале мы бы хотели иметь аденилатциклазы, которые реагируют на свет с большей длиной волны, а в особенности на красный или инфракрасный свет, потому что инфракрасное излучение более мягкое, оно не нарушает ткани так, как синий свет, да и рассеивается меньше. Так что если мы хотим в перспективе использовать эту технологию, чтобы «включить» регенерацию нейронов, находящихся на глубине двух сантиметров под поверхностью кожи, то нам определенно нужно использовать инфракрасный свет. Одним из возможных решений может быть использование не только лишь оптогенетики, а еще, к примеру, оптохимии, однако это только на ранних стадиях разработки.

Существует несколько подходов в области оптохимии, однако существует один, подающий особенные надежды. Он состоит в том, чтобы дать животному или человеку неактивный препарат, который сам по себе ничего не сможет сделать, однако в случае активации он сможет вызвать нужный ответ в клетке. И таким ответом, помимо всего прочего, может быть активация аденилатциклазы. Инструментом переведения этого препарата из неактивного состояния в активное может быть свет. Так что даже если этот препарат распространится по всему организму, мы будем иметь возможность активировать его только в нужной нам части, оставляя его бездействующим во всех остальных. Одним из способов проведения такого рода операции будет, так сказать, заключение препарата в своеобразную «клетку». Эта «клетка» будет предотвращать действие препарата, и она может быть разрушена или «открыта» светом. Таким образом препарат можно «освободить» там, где нам нужно, и тогда, когда нам нужно.

Перспективы области

Я так думаю, в ближайшем будущем мы будем постепенно совершенствовать технические аспекты оптогенетического метода, так что они станут лучше, с ними будет легче работать, они будут быстрее, и мы сможем использовать их в более сложных системах и организмах. Так что это один аспект нашей области, который ждет, так сказать, светлое будущее — по-моему, очень подходящее выражение, поскольку наш метод основан на использовании света. Другой достаточно перспективный аспект — это клиническое применение этой техники, хотя прогресс тут будет более сложным и медленным. Пока что не так много было сделано в этой области, или как минимум не о столь многих успехах известно, однако, я бы сказал, идет активная работа, которая рано или поздно принесет плоды.

По сути дела, перед нами стоят два вопроса, на которые мы будем пытаться найти ответ. Первый, биологический — это до какой степени мы можем использовать свет для регенерации как отдельных клеток, так и целых нервных цепей и насколько это помогает восстановить прежние функции и поведение животного. Это одна вещь, которую мы пытаемся сделать. Вторая стоящая перед нами задача — узнать, как мы можем повторить успех наших экспериментов с рыбками в экспериментах с мышами, крысами, в частности, при повреждениях спинного мозга. Это серьезная задача — эта проблема не была еще решена в случае людей: паралич от повреждения спинного мозга трудно вылечить или преодолеть. Так что потенциально в будущем, мне кажется, наша технология сможет помочь лечить травмы такого рода у людей и животных.