Планета Земля образовалась примерно 4,6 млрд лет назад. Доподлинно не известно, что конкретно происходило на ней примерно в течение следующего миллиарда лет. Однако относительно конца этого первого миллиарда лет кое-какие сведения уже имеются. К концу этого периода (около 3,5 млрд лет назад) относятся первые строматолиты — карбонатные слоистые отложения, в которых встречаются следы цианобактерий.

Если сравнить морфологию (внешний вид) современных и древних цианобактерий, то они мало чем отличаются друг от друга. По поводу происхождения разнообразия форм цианобактерий имеются разные теории, однако все они основаны на современных алгоритмах разнообразных расчетов и имеют те или иные погрешности, связанные в основном с тем, что оперировать приходится периодами в сотни миллионов лет как минимум. Оглядываясь на этот бесконечно длинный по человеческим меркам временной отрезок, можно с достаточной уверенностью сказать одно: цианобактерии являются одними из древнейших организмов на Земле.

Именно этим древним организмам мы обязаны тем, что жизнь на Земле в конечном счете получилась такая, какая есть. Это произошло благодаря изобретению цианобактериями процесса фотосинтеза и насыщению атмосферы кислородом. Кроме того, согласно симбиотической теории, цианобактерии являются предшественниками хлоропластов высших растений — органелл, которые поглощают и фиксируют CO2, а также выделяют кислород, синтезируя при этом еще и целый набор энергетически ценных (другими словами, питательных) веществ: глюкозу, сахарозу, крахмал, липиды, белки, пигменты и т. д.

1. Реликтовые цианобактерии на современной Земле

Потомки древних цианобактерий существуют до сих пор. После образования Земли в ее атмосфере было очень много углекислого газа и очень мало кислорода. Цианобактерии этот процесс повернули в обратную сторону: теперь у нас много кислорода и мало углекислого газа.

Рекомендуем по этой теме:
5881
Сенсорные системы цианобактерий

В настоящее время существуют так называемые реликтовые цианобактерии, которые когда-то давно, когда в атмосфере уже появился кислород, но было еще довольно много углекислого газа, были вытеснены более совершенными и приспособленными эукариотическими формами жизни в экстремальные места обитания. Сейчас такие экстремальные места можно найти на планете — это, например, содовые озера. Там сплошная сода, то есть бикарбонат, растворенная углекислота. Вот в таких местах, напоминающих условия древней атмосферы Земли, какой она была пару миллиардов лет назад, живут так называемые реликтовые цианобактерии, которые могут быть прямыми потомками древних клеток, обеспечивавших Землю первым кислородом.

Наша задача заключается в том, чтобы разобраться, как эти простые организмы чувствуют изменения, которые происходят в окружающей среде. Например, поменялась температура: как клетка чувствует изменение температуры? Поменялась соленость: как клетка ощущает изменение солености?

Почему и зачем это нужно? Мы сейчас находимся на переходном этапе от «черной» (угольно-нефтяной) к «зеленой» планете. Концепция «зеленой» планеты заключается в замещении невозобновляемых сырьевых и энергетических ресурсов возобновляемыми продуктами, которые можно получать из фотосинтезирующих организмов за счет энергии Солнца. То есть речь идет о том, чтобы энергия и материя, включая еду, были, как теперь модно говорить, экологически чистыми, чтобы мы все получали из растений, водорослей и цианобактерий, питающихся почти исключительно водой (плюс минералы) и энергией Солнца и перерабатывающих эту химически незамысловатую основу в весьма замысловатые и полезные для нас продукты. И, как водится, желательно, чтобы все это было бесплатно или, по крайней мере, недорого. Для того чтобы такой «зеленой технологией» овладеть, необходимы глубокие знания метаболических и регуляторных путей в тех организмах, которые мы пытаемся приспособить работать на наши нужды.

2. Круговорот кислорода и углекислого газа

Многие думают, что мы сейчас дышим кислородом, который вырабатывают растения, например тропические леса или наши сибирские леса, тайга. На самом деле это не совсем так. В действительности леса дают нам около половины кислорода, а остальную половину мы получаем из океана от фитопланктона, и в этом фитопланктоне львиная доля принадлежит цианобактериям.

То же самое относится и к утилизации углекислого газа. Это проблема считается сейчас острой и актуальной. Леса перерабатывают примерно 50% углекислого газа от того количества, что выделяется на планете Земля. Остальные 50% (даже, возможно, более — в районе 50–60%) поглощаются тем же фитопланктоном. Весь этот углерод забирается из атмосферы и превращается в органическое вещество. Чем больше дать CO2 растениям, а особенно микроводорослям, тем больше они его свяжут и превратят в органику, выделив при этом эквивалентное количество кислорода. В этом смысле буферная способность океана практически безгранична. По крайней мере, в рамках той ничтожной активности, которую проявляет человек — хозяин и оператор заводов, газет, пароходов и прочего. По некоторым подсчетам, водные и наземные фотосинтетики способны переработать гораздо больше, чем сегодня дают «дышащие» Земля (включая вулканическую деятельность) и человек (включая всю его производственную активность).

3. Изучение клеток в стрессовых условиях

Наша конкретная задача — выяснить, как клетки цианобактерий чувствуют изменения, происходящие в окружающей среде. На самом деле задача эта достаточно сложная, и решить ее методически не так-то просто, в основном потому, что зачастую проблема поиска формулируется общеизвестным выражением «пойди туда — не знаю куда, найди то — не знаю что». Тем не менее разумные подходы к такого рода поискам существуют.

Например, для начала мы должны определить клетку в какие-то стрессовые условия. Почему именно в стрессовые условия? Потому что если мы будем наблюдать за нормальной жизнедеятельностью клетки или организма, то, скорее всего, мы ничего не заметим. Нужна какая-то реакция, которая выходила бы за пределы нормы. Тогда мы можем каким-то образом зафиксировать ответы клеток и, соответственно, изучить, как это происходит, каковы механизмы, которые запускают эти ответы.

Разнообразные стрессовые ответы можно изучать сколь угодно долго. Например, мы можем задаться, казалось бы, тривиальным вопросом: как клетка воспринимает снижение температуры окружающей среды? Можно набросать следующую гипотетическую схему: первое, что должно произойти, — это реакция какой-то молекулы или системы молекул в клетке, которые чувствительны к этому температурному изменению. Эти молекулы мы условно назовем сенсорами. Далее сигнал должен передаваться другими молекулами — передатчиками к генам, кодирующим белки, отвечающим за низкотемпературный ответ. Следующий этап — эти гены должны экспрессироваться, то есть транскрибироваться и транслироваться, в конечном счете образуя какой-то продукт — метаболит. А уже за этим продуктом мы можем следить и, таким образом, оценивать ответную реакцию клеток на внешнее воздействие. Однако не за всеми конечными продуктами легко и приятно следить.

Рекомендуем по этой теме:
7430
FAQ: Физиология микроводорослей

Чтобы упростить себе задачу, мы можем сделать полуискусственную модельную систему. Если известно, что некий ген сильно индуцируется низкой температурой, а следить за его конечным продуктом по какой-то причине неудобно, мы можем взять регуляторный участок этого гена, который запускает низкотемпературный ответ, и к этому регуляторному участку пришить (это делается стандартными методами генетической инженерии), например, чужой ген люциферазы — светящегося белка. Тогда по свечению можно определить, запустилась система ответа или нет. Снижение температуры должно вызывать активацию свечения. Если температура снижается, а свечения не видно, это значит, что система не работает.

Такие клетки, отвечающие свечением на снижение температуры, подвергают случайному мутагенезу, чтобы впоследствии выделить те мутантные клоны, которые потеряли способность к свечению, а значит, к низкотемпературному ответу. Затем в таких мутантах определяют место появления мутации и, соответственно, индивидуальный ген, который отвечает за реакцию на снижение температуры. Понятно, что у мутанта может быть поврежден вовсе не один ген, а несколько или даже множество.

Этот подход достаточно трудоемок, но в данном случае, когда поиск только начинался, по-другому поступить было невозможно. Такую методологию мы применили в 2000 году и обнаружили, что за восприятие низкой температуры в клетках модельных цианобактерий отвечает сенсорный мембранный белок с функцией гистидинкиназы.

4. Двухкомпонентные системы регуляции стрессовых ответов у бактерий

Гистидинкиназы — это белки, которые относятся к двухкомпонентным системам регуляции. Это очень широко распространенные системы регуляции у бактерий, состоящие из белка-сенсора (гистидинкиназы) и белка-передатчика (регулятора ответа). Принцип работы этих систем достаточно прост. Сенсорная гистидинкиназа — это белок, который может фосфорилировать либо сам себя, либо другие белки. Присоединение фосфата (фосфорилирование) — это химический способ довести до сведения клетки, что вне ее (или внутри ее) что-то изменилось и что пришла пора в связи с этим заводиться и что-то предпринимать в ответ. Гистидинкиназа выступает в качестве сенсора.

При снижении температуры клеточная мембрана сжимается, мембранный сенсор меняет свою конформацию и фосфорилирует сам себя.

Присоединяя фосфат, сенсор активируется и становится способным передать этот фосфат строго определенному регулятору ответа. Последний принимает фосфат от гистидинкиназы, таким способом активируется и получает возможность взаимодействовать с регуляторными областями генов, запуская их работу. Так работает двухкомпонентная система восприятия, где один белок является сенсором, чувствующим физические изменения параметров в клетке, а второй — передатчиком этих изменений к соответствующим генам ответа.

В 2000 году нам удалось идентифицировать только один сенсорный компонент одной из таких систем, отвечающей за холодовой ответ. Только через шесть лет, в 2006 году, другая группа исследователей смогла определить второй компонент — передатчик. Таких двухкомпонентных систем у цианобактерий и у других бактерий очень много. Например, в геноме нашего модельного организма, Synechocystis, имеется 45 гистидинкиназ — потенциальных сенсоров — и столько же регуляторов ответа. У цианобактерий двухкомпонентные системы регуляции разбросаны по геному, в отличие от других бактерий, у которых эти системы расположены в геноме парами — сенсор + передатчик. В этом заключается дополнительная трудность при определении специфичности реакции на стресс и при поиске белков-партнеров у цианобактерий.

5. Сравнение штаммов при помощи ДНК-микрочипов

Тем не менее можно получить мутантные штаммы, в каждом из которых выключен один из генов, кодирующих компоненты регуляторных систем. Это очень трудоемкая и долгая работа. Однако легкую работу может сделать кто угодно, в то время как трудную работу никто делать не хочет. Именно поэтому мы и предпочитаем браться за трудную работу: в таком случае, по крайней мере, имеется некоторый шанс преуспеть…

В итоге мы получили этих мутантов — 2 набора по 45, всего 90 штук мутантных штаммов. К этому времени удивительным образом подоспела технология изготовления ДНК-микрочипов. Генный микрочип — это фактически предметное микроскопное стекло 8 см длиной и 2 см шириной, на котором расположен полный геном организма в двукратной повторности. Конечно, полные геномы растений или животных на такой малой площади поместить невозможно, но малые размеры геномов одноклеточных бактерий позволяют это делать. При помощи микрокапиллярной технологии на стекло наносятся и прикрепляются точки, каждая из которых представляет собой индивидуальный фрагмент ДНК, соответствующий определенному гену.

Сравнивая активность транскрипции генов с помощью таких геномных микрочипов, можно сразу увидеть, к чему приводит та или иная мутация. Также можно определить, какие именно гены активируются или замолкают в ответ на то или иное (в том числе стрессовое) воздействие. Сравнивая ответы на генетическом уровне исходных штаммов и мутантов на стрессовые воздействия, можно обнаружить регуляторные гены, контролирующие стрессовые ответы. Если повезет.

6. Гены и их функции

Многие мутации никак не проявляются фенотипически. То есть организм вам не дает никакой информации о себе. Вы мутировали какой-то ген, какой-то белок не образуется, а что это значит для организма — непонятно. Он живет себе так же, как и жил. Для выявления функции генов существуют другие технологии. Например, сейчас очень широко распространены подходы фосфопротеомики, когда можно увидеть, какой именно белок появился или пропал в том или ином мутанте, а также фосфорилирован ли он.

В общем, подходов бывает много. Вообще, задачи определения функций ранее неизвестных генов и белков, не говоря уже о выявлении компонентов сенсорных систем, увлекательны и интересны. А генов с неизвестной функцией до сих пор остается множество, даже в простых организмах. Например, в геноме Synechocystis имеется около 3,5 тысяч генов, кодирующих белки. В ответ на тепловой, холодовой или солевой стрессы активируется 100–200 генов. Удивительно, что мы знаем функции только примерно половины из них. Это в лучшем случае. О другой половине генов мы вообще ничего не знаем. Зачем они нужны, в каких процессах участвуют продукты этих генов? Что они регулируют? С одной стороны, это печально, поскольку оказывается, что мы очень мало знаем даже о простейших организмах… Но, с другой стороны, перед исследователями открываются невиданные ранее поля деятельности, так что будущее сулит нам не только безмятежную «зеленую» планету, но и множество «открытий чýдных».

1. Заварзин Г.А. Антипод ноосферы. Вестник РАН 7, 2006. С. 627–636.

2. Эволюция биосферы и биоразнообразия. К 70-летию А. Ю. Розанова. М., Товарищество научных изданий КМК, 2006. 600 стр.

3. Лось Д. А. Сенсорные системы цианобактерий. М., Научный Мир, 2012. 218 стр.