1. Размеры нанобактерий
Предел разрешения инструмента, используемого в рутинной практике для исследования бактерий, — оптического микроскопа — составляет 0.2 микрометра, или 200 нанометров. Объекты размером менее двухсот нанометров в оптический микроскоп не видны. Так как оптический микроскоп — это основной рабочий инструмент большинства микробиологических лабораторий в мире, становится ясно, почему нанобактерии долгое время не попадали в поле зрения микробиологов. Для выявления нанобактерий нужен электронный микроскоп, который доступен далеко не в каждой лаборатории или в институте.
Размер 0.2 микрометра, или 200 нанометров, соответствует диаметру пор фильтров, которые в настоящее время используются для фильтрации проб воды, сывороток и различных растворов с целью их очищения от клеток бактерий. Принято считать, что пропущенные через такие фильтры растворы уже не содержат микробных клеток. Нанобактерии, однако, через эти фильтры проходят, поэтому вторым термином, используемым для обозначения этих организмов, является термин «фильтрующиеся бактерии». Третий термин-синоним — это «ультрамикробактерии». Этот термин является самым корректным с научной точки зрения и наиболее широко используется.
Каково же численное определение категории «ультрамикробактерии»? К этой категории в настоящее время относят микробные клетки, объем которых не превышает одной десятой доли кубического микрометра. Исходя из формул определения объемов геометрических фигур, это либо сферические клетки с диаметром не более 500 нанометров, либо очень тонкие палочки с диаметром 150–200 нанометров и длиной до нескольких микрометров. Подобные микробные клетки попадают в категорию ультрамикробактерий.
2. История открытия ультрамикробактерий
Первые сообщения об образовании некоторыми бактериями ультрамелких клеток относятся к 30-м годам прошлого века. Эти наблюдения были сделаны благодаря использованию фильтрации для стерилизации сред и растворов. Как оказалось, фильтрация через используемые в то время фильтры с размером пор 0.45 микрона не приводила к желаемому результату получения стерильных сред. Позднее фильтрующиеся клетки микроорганизмов были выявлены не только в лабораторных культурах, но и в природных средах. В частности, исследование воды, почвы и других образцов из разных экосистем с использованием электронной микроскопии показало, что микробные клетки ультрамалых размеров распространены повсеместно.
Sherman J. M., Safford C. E., The occurrence of filterable forms of bacteria in nature, Science, 1928, Vol. 73, No. 1928, 448 — 449. Sherman J. M., Safford C. E., Primitive or filterable forms of bacteria, Science, 1928, Vol. 74, No. 1928, 602 — 603
До 1998 года, однако, все подобные исследования носили характер естественно-научных наблюдений. А в 1998 году была опубликована работа в журнале докладов Американской академии наук (PNAS), в которой было заявлено об обнаружении в сыворотке крови человека частиц наноразмеров (от 20 до 500 нанометров в диаметре), имеющих форму микробных клеток. Ультратонкие срезы этих объектов также обнаруживали некоторое сходство со срезами бактериальных клеток. Как было показано, эти нанообъекты выступали в качестве центров осаждения фосфата кальция, что послужило основанием для предположения их роли в процессах образования камней и кальцификации сосудов. Утверждалось, что выявленные объекты способны к медленному размножению и устойчивы к нагреванию. Были приведены и данные их молекулярной идентификации по определению последовательности гена 16S рРНК, в соответствии с которыми они принадлежали к классу Alphaproteobacteria и были филогенетически близки к известным патогенам родов Brucella и Bartonella. Выявленные объекты было предложено отнести к новому роду — роду Nanobacterium, откуда и произошел термин «нанобактерии».
Kajander E.O. and Ciftcioglu N. Nanobacteria — an alternative mechanism for pathogenic intra- and extracellular calcification and stone formation. PNAS. 1998. 95(14): 8274–8279
Это сообщение вызвало очень большой интерес не только медиков, но и специалистов различных сопредельных областей. В последующем шквале публикаций нанобактерии были выявлены практически повсеместно — как в живых, так и в неживых объектах. Особенно большое количество сообщений о выявлении нанобактерий было сделано геологами. Заключения последних были построены лишь на наблюдении сверхмелких объектов (100–300 нанометров и менее в диаметре) в различных геологических породах. В подавляющем большинстве таких публикаций никаких свидетельств в пользу биологической природы наблюдаемых объектов получено не было.
3. Минимальные размеры живой клетки
Растущее количество спекулятивных публикаций по повсеместному выявлению нанобактерий заставило микробиологов всерьез задуматься о том, насколько мала может быть микробная клетка. Для этого в 1999 году было созвано экстренное рабочее совещание, на котором обсуждался вопрос о минимальных размерах микроорганизмов.
Принятый большинством ученых консенсус в отношении минимального размера, обеспечивающего самостоятельное существование живой клетки, сводится к объему от 0.014 до 0.06 кубических микрометров и диаметру от 150 до 300 нанометров. Эти выкладки основаны на том, что растущая и делящаяся клетка должна обладать неким минимальным объемом для размещения «метаболической машины», обеспечивающей ее функционирование. Безусловно, необходимыми компонентами являются ДНК, РНК, рибосомы, ферменты транскрипции и трансляции, минимальный набор белков и липидов, вещества цитозоля и соответствующее периплазматическое пространство. Таким образом, если размер одной рибосомы составляет 15–20 нанометров, то вся клетка, которая должна содержать как минимум сотню рибосом, никак не может иметь диаметр в 20 нанометров.
Size Limits of Very Small Microorganisms, Proceedings of a Workshop, Washington DC, 1999
4. О нанобактериях в сыворотке крови
Спустя 10 лет после опубликования сообщения о выявлении нанобактерий в сыворотке крови, в том же журнале (PNAS) было опубликовано другое исследование. В нем элегантно доказывалось, что полностью идентичные нанобактериям по виду частицы могут образовываться в сыворотке крови в результате химического осаждения карбоната кальция, а эти микрочастицы, в свою очередь, служат центрами осаждения фосфата кальция. В этой работе был приведен и целый ряд исчерпывающих доказательств небиологической природы наблюдаемых в сыворотке крови наночастиц. Ко всему прочему, нанобактерии из крови не удавалось выделить в культурах. Данные их молекулярной идентификации с накоплением обширной базы данных последовательностей генов 16S рРНК стали выглядеть совсем по-иному. Последовательности выявленных в работе 1998 года нанобактерий оказались идентичны таковым у представителей рода Phyllobacterium, широко распространенным непатогенным гетеротрофам, которые являются обычными загрязнителями (контаминантами) лабораторной посуды и сред. Таким образом, существование специфических бактерий рода Nanobacterium было опровергнуто, что, однако, не опровергает существование микроорганизмов с клетками наноразмеров.
Martel J., Young J.D.-E. 2008. Purported nanobacteria in human blood as calcium carbonate nanoparticles. PNAS 105 (14): 5549-5554
5. Доказательство существования нанобактерии
Несмотря на обилие противоречивой информации, а также ряда откровенных спекуляций относительно нанобактерий, микробные клетки наноразмерного диапазона существуют. К настоящему времени микробиологам известен целый ряд бактерий и архей, имеющих клетки с объемом менее 0.1 кубического микрометра. Многие из этих микроорганизмов даже получены в чистых культурах и хорошо изучены. Характерной особенностью таких микроорганизмов является малый размер генома — от 0.5 до 3.2 миллиона пар оснований.
Одним из примеров ультрамикробактерий, широко распространенных в океанических водах, является Pelagibacter ubique. По свидетельству молекулярных данных до 20% всех нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, выявляемых в океанической воде, принадлежат бактериям этого рода и вида. Это действительно очень маленькая бактерия, которая проходит через поры бактериальных фильтров, и размер ее генома тоже очень мал — 1.3 миллиона пар оснований. Это абсолютно свободноживущая, непаразитическая бактерия, которая растет очень медленно. Примеров таких организмов немало. В природе такие формы вовсе не редкость.
Giovannoni S. J., Tripp H. J., Givan S., Podar M., Vergin K. L., Baptista D., Bibbs L., Eads J., Richardson T. H., Noordewier M., Rappe M. S., Short J. M., Carrington J. C., Mathur E. J. Genome streamling in a cosmopolitan oceanic bacterium. Science, 2005, Vol. 309, 1242 — 1248
6. Опасные ультрамикробактерии
Существуют ли какие-то потенциально опасные ультрамикробактерии? Да, действительно, такие примеры есть. Один из таких примеров — это Minibacterium massiliensis, подвижная бактерия, которая была выделена из так называемой ультрачистой воды, используемой в госпиталях для гемодиализа. Оказалось, что такие бактерии способны пройти несколько стадий очистки, включающие не только фильтрацию, но и обработку ультрафиолетом. Эти бактерии принадлежат к классу Betaproteobacteria. Геном у Minibacterium massiliensis оказался не такой уж маленький — около 4 миллионов пар оснований.
При анализе генома были найдены множественные факторы устойчивости к антибиотикам и тяжелым металлам, а также более ста пятидесяти факторов вирулентности. Другими примерами патогенных бактерий с клетками наноразмеров являются такие хорошо изученные микроорганизмы, как Brucella, Mycoplasma, Rickettsia и Chlamydia.
Audic S., Robert C., Campagna B., Parinello H., Claverie J-M., Raolt D., Drancourt M., Genome analysis of Minibacterium massiliensis highlights the convergent evolution of water-living bacteria, PLoS Genet, 2007, 3(8): e138
7. Ультрамикробактерии в природной питьевой воде
В последние десятилетия очень широко исследуется вопрос о присутствии ультрамикробактерий в питьевой природной воде. Эти исследования были начаты швейцарскими микробиологами, которые провели учет фильтрующихся клеток не только в водоемах Швейцарии, но также в знаменитой швейцарской бутилированной воде. Оказалось, что даже в бутилированной воде количество клеток таких микроорганизмов составляет тысячи клеток в одном миллилитре. В природной воде их на порядок больше — десятки тысяч клеток в одном миллилитре.
Позже были сделаны попытки выделения этих организмов в чистых культурах. В частности, много работ по выделению таких клеток было выполнено австрийскими микробиологами, но и мы также последние годы исследовали фильтрующиеся микроорганизмы. В частности, наша лаборатория проводила исследование вод природных водоемов на водосборах Верхней Волги и вод Рыбинского водохранилища. Наши исследования показали, что численность фильтрующихся микроорганизмов в них достаточно высока, составляет десятки тысяч клеток в одном миллилитре воды. Среди этих клеток есть как бактерии, так и археи совершенно неизвестных групп. Исследование геномного потенциала, а соответственно, и функционального потенциала этих организмов представляет важную задачу для дальнейших исследований.
Федотова А.В., Серкебаева Ю.М., Сорокин В.В., Дедыш С. Н. 2013. Фильтрующиеся формы микроорганизмов в водах Рыбинского водохранилища. Микробиология, Т. 82, № 6, с. 715-722
