1
Белком, для которого был измерен первый спектр ЯМР, была рибонуклеаза А. Спектр представлял собой просто набор «бугров», из которых никакой структурной или иной полезной информации в то время получить не удавалось. Спустя 20 лет, в конце 70-х годов, была создана уже мощная методология Фурье-спектроскопии ЯМР, и появились первые методы двумерной спектроскопии ЯМР. Создание методов двумерной спектроскопии дало реальный мощный импульс к изучению сложных соединений, таких как белки и нуклеиновые кислоты. Безусловно, основной вклад в развитие этого направления принадлежит Нобелевскому лауреату, швейцарскому учёному Ричарду Эрнсту. Были созданы несколько дополняющих друг друга методик, например, так называемая спектроскопия NOESY, то есть спектроскопия ядерного эффекта Оверхаузера (Nuclear Overhauser Effect) — метод, позволяющий детектировать межъядерные контакты. Если протоны сближены в пространстве, то в таком двумерном спектре появляются кросс-пики в положениях, соответствующих этим двум взаимодействующим через пространство протонам.
M. Saunders, A. Wishnia and J. G. Kirkwood. 1957. The Nuclear Magnetic Resonance Spectrum of Ribonuclease. Journal of the American Chemical Society. 79:3289-3290.
R. R. Ernst. 1992. Nuclear Magnetic Resonance Fourier Transform Spectroscopy (Nobel Lecture). Angewandte Chemie International Edition. 31:805-823
2
Двумерные спектры COSY, так называемая корреляционная спектроскопия: если протоны взаимодействуют друг с другом через систему валентных электронов, имея отличную от нуля константу спин-спинового взаимодействия, то есть они разделены не более, чем тремя химическими связями друг от друга, то мы в этом спектре видим соответствующие кросс-пики. И также был создан ряд комплиментарных методик, например, TOCSY — для детектирования всех протонов, принадлежащих одному аминокислотному остатку белка. Оказалось, что если мы проанализируем двумерный спектр относительно небольшого белка, с молекулярной массой, скажем, до десяти тысяч дальтон, то эти методики COSY, TOCSY и NOESY способны дать нам информацию достаточную для отнесения сигналов, то есть для идентификации каждого из протонов такого белка. Такой информации, которую мы получим из этих спектров, достаточно чтобы рассчитать структуру белка. В 1983-м году группой ученых под руководством Нобелевским лауреатом Курта Вютриха была рассчитана первая структура относительно небольшого белка, но это был прорыв — до того времени единственным методом определения структуры биомолекул являлась рентгеновская кристаллография. Наконец, появился альтернативный метод. Во-первых, этот метод позволяет определить структуру в растворе, а не в кристалле, а, во-вторых, физические основы этого метода принципиально отличаются от рентгеноструктурного анализа.
K. Wüthrich. 2003. NMR Studies of Structure and Function of Biological Macromolecules (Nobel Lecture). Angewandte Chemie International Edition. 42:3340-3363.
3
Далее методология ЯМР стала довольно быстро развиваться. Было установлено, что, крайне полезную информацию для изучения биомолекул могут дать не только протоны, но и более тяжёлые ядра, например такие, как углерод-13. Его естественное содержание сравнительно невелико — около 1%, но вполне можно вырастить белок на обогащенной изотопом углерода-13 среде и, таким образом, повысить содержание магнитно-активного изотопа углерода почти до 100%. Это же относится к изотопу азота-15, естественное содержание которого еще втрое меньше. Получение меченых стабильными и магнитно-активными изотопами C-13 и N-15 белков позволило создать методы, так называемой, гетероядерной спектроскопии, то есть спектральные методики корреляции этих тяжёлых ядер углерода или азота, и протонов, с ними связанных. И, наконец, комбинация классических методов TOCSY, COSY и NOESY, о которых было сказано выше, с гетероядерными методами позволила создать методы многомерной спектроскопии ЯМР. Например, в трёхмерной (3D) спектроскопии информация разнесена по трём осям: по одной оси тяжелое ядро (азот-15 или углерод-13), по второй — протон, связанный химической связью с этим тяжелым ядром, и по третьей оси — любой другой протон, взаимодействующий с предыдущим через пространство или посредством спин-спиновой связи.
D. Marion, P.C. Driscoll, L.E. Kay, P.T. Wingfield, A.Bax, A. M. Gronenborn and G. M. Clore. 1989. Overcoming the Overlap Problem in the Assignment of H-1-NMR Spectra of Larger Proteins by Use of 3-Dimensional Heteronuclear H-1-N-15 Hartmann-Hahn Multiple Quantum Coherence and Nuclear Overhauser Multiple Quantum Coherence Spectroscopy — Application to Interleukin-1-beta. Biochemistry. 28:6150-6156.
4
Указанные подходы позволили создать методологию, способную изучать не только маленькие белки, как это было в начале развития спектроскопии ЯМР биомолекул, а белки до 20-ти, 30-ти килодальтон и выше. Сейчас ограничение на молекулярную массу изучаемого объекта быстро расширяется. В последние годы появились работы, в которых исследователи разных стран публикуют данные об отнесении сигналов белков или комплексов белков вплоть до мегадальтонного размера. Это, безусловно, чрезвычайно расширяет возможности метода ЯМР. Очень важно и то, что спектроскопия ЯМР позволяет не только получать информацию о структуре — ее довольно успешно получают методом рентгеноструктурного анализа, но можно получить очень ценную информацию о динамических свойствах белковых систем, и здесь метод ЯМР уникален. То есть мы можем до атомного разрешения получить информацию о том, с какими характеристическими частотами, т. е. как быстро, и с какими амплитудами движутся те или иные фрагменты белковой молекулы. Причём эти характеристические времена исследуемых движений лежат от пикосекунд и вплоть до часов, то есть, до спектроскопии ЯМР в реальном времени.
R. Sprangers and L. E. Kay. 2007. Quantitative dynamics and binding studies of the 20S proteasome by NMR. Nature. 445:618-622.
A. K. Mittermaier and L. E. Kay. 2009. Observing biological dynamics at atomic resolution using NMR. Trends in Biochemical Sciences. 34:601-611.
5
И, наконец, третье направление, которое чрезвычайно важно — это возможности метода ЯМР для мониторинга взаимодействия различных молекул, например, изучения взаимодействия низкомолекулярных соединений с биомолекулами. Такими биомолекулами могут быть белки-мишени, — т. е. те, на которые действует то или иное лекарство, а низкомолекулярными соединениями могут быть лекарственные препараты, которые мы применяем, либо те соединения, которые потенциально могут ими стать. И ввиду чрезвычайно высокой информативности метода ЯМР к определению способности низкомолекулярных соединений связываться с белками, этот метод стал очень бурно развиваться в последние годы в приложении к поиску лекарственных средств. Появились подходы, называемые ЯМР-скринингом, которые нацелены на идентификацию соединений или даже маленьких молекулярных фрагментов будущих лекарств, которые связываются с тем или иным карманом белка-мишени. Причём с помощью ЯМР можно позиционировать различные молекулярные фрагменты, а потом, сочленяя их, получать довольно высоко-аффинное соединение, которое в перспективе может стать хорошим лекарством.
M. Pellecchia, D. S. Sem, and K. Wüthrich. 2002. NMR in drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 1:211-219.
6
Большинство крупных фармацевтических компаний, начиная с конца 90-х годов XX века, а в последнее десятилетие это быстро происходит, стали использовать методики ЯМР-скрининга. Практически у всех них эта методология широко применяется. Если посмотреть на список биологически активных соединений, которые находятся на той или иной фазе доклинических или клинических испытаний, то оказывается, что не менее трети из них отобрано с помощью методов ЯМР-скрининга. Нужно отметить два различных направления применения ЯМР к поиску лекарств. Первое направление связано с идентификацией сигналов самой биомишени, то есть того белка, который является мишенью действия препарата. Такой белок должен быть, безусловно, изучен методом ЯМР, в частности для него должна быть получена информация об отнесении сигналов. А далее есть целый ряд методик ЯМР, которые позволяют чётко позиционировать карман связывания низкомолекулярного соединения, потенциального лекарства, с этим белком-мишенью. Методология молекулярных фрагментов (fragment-based drug design, FBDD), использует информацию, полученную с помощью ЯМР для осмысленного сочленения небольших молекулярных фрагментов в более крупную молекулу, которая потенциально может стать лекарством.
S.B. Shuker, P. J. Hajduk, R. P. Meadows and S. W. Fesik. 1997. Discovering high-affinity ligands for proteins: SAR-by-NMR. Science. 274:1531-1534.
7
Второе направление не предполагает получения информации об отнесении сигналов ЯМР белка-мишени. Мало того, такой белок может быть чрезвычайно большим с точки зрения ЯМР и неудобным для измерения его спектров. Но и такой белок может исследоваться с помощью методик ЯМР-скрининга. Для этого применяется второй подход, основанный на мониторинге свойств низкомолекулярных соединений. Можно, детектируя то или иное свойство низкомолекулярного фрагмента, говорить о том, что он связывается или не связывается с биомишенью. Построив разумным образом, шаг за шагом, схему изменения структуры этого фрагмента и детектируя его свойства связываться с биомишенью с помощью ЯМР, можно приближаться к структуре все более эффективного соединения. Такое соединение будет по своим свойствам приближаться к потенциальному лекарству, т. е. иметь эффективные константы связывания с белком-мишенью и другие свойства, характерные для лекарственного препарата. Далее, впрочем, потребуется еще долгий путь его углубленных доклинических и клинических испытаний, но это уже совсем другая история, в которой, впрочем методы ЯМР занимают далеко не последнее место.
B. J. Stockman and C. Dalvit. 2002. NMR screening techniques in drug discovery and drug design. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 41:187-231.
