1
Флуоресцентные белки, которые, будучи белками, генетически кодируемы, происходят на свет путём синтеза белковой последовательности, закодированной в участке ДНК. Такие гены, и, соответственно, такие белки встречаются в различных морских организмах: в медузах, в коралловых полипах, мягких и твёрдых, в рачках, в ланцетниках (хордовых) — но встречаются они почему-то только в море. Они могут быть различных цветов: зелёные, красные, жёлтые, синие. Их можно совершенствовать, и учёные во всём мире работают над тем, чтобы разработать более яркие или более быстро созревающие, или более устойчивые к обесцвечиванию флуоресцентные белки (также, как и любой краситель, они при интенсивном и продолжительном облучении выгорают, и это мешает исследователям в их работе).
Таким образом, речь идёт не об одном каком-то флуоресцентном белке, а о множестве разных вариантов, природных и разработанных позднее учёными — во всём мире множество лабораторий работает в этом направлении. Вы можете взять участок, кодирующий флуоресцентный белок, небольшой ген в 700 нуклеотидов, и физически перенести его в другой организм, в бактерию, в линию клеток эукриотических, в трансгенную мышь, лягушку, зверюшку — в кого угодно. И далее этот организм, эта живая система своими собственными клетками будет использовать этот генетический материал и сама вырабатывать флуоресцентный белок, фактически, сама себя метить.
2
Это свойство даёт в руки исследователям необозримые возможности. Вы можете сделать трансгенный организм и пометить его целиком, но, так как ген всегда можно поместить в окружение, которое будет определять его активность более специфическим образом, то возможности сразу открываются более широкие. Например, вы можете поставить ген флуоресцентного белка под промотер, который активен в клетках определённого типа, и ваша трансгенная мышка будет флуоресцировать не вся, а только, например, клетки печени. Вы можете поставить ген флуоресцентного белка под такой промотер, который активен, например, на определённой стадии развития, и маркировать стадии развития живого организма.
Можно ген флуоресцентного белка добавить рядом с геном, кодирующим какую-то другую пептидную последовательность, и получить то, что называется химерный белок (белок-слияния), в котором с этой, уже химерной конструкции ДНК, будет считываться не просто флуоресцентный белок, а флуоресцентный белок, несущий на себе ещё дополнительную пептидную последовательность, которая, например, направляет его в митохондрии или в ядро, или на мембрану клетки, или на мембрану клетки в определённых условиях. В определённых условиях он будет мигрировать, в ответ на какие-то внешние раздражители, с мембраны в цитоплазму или в ядро.
Можете получить белок-слияние с любым вашим белком интереса, с сохранением его функциональной активности, то есть, в результате в клетке ваш исследуемый белок, который что-то делает, как-то расположен, будет помечен флуоресцентным красителем, и клетка будет сама эту конструкцию производить. Так как цветовых вариантов много, то вы можете пометить множество белков, осуществить многоцветное мечение и посмотреть, как они взаиморасположены в живой клетке, и как их расположение меняется по ходу жизни клетки в ответ на какие-то внешние раздражители.
3
Можно (и это более сложное и сегодня активно развивающееся направление) делать очень точным и конкретным образом жёстко слитые конструкции, состоящие из флуоресцентного белка и каких-то чувствительных доменов, например связывающих ионы кальция, и методом продолжительной генно-инженерной работы собирать такие конструкции, которые в ответ на связывание ионов кальция этими доменами способны так изменять свою конформацию (и в результате конформацию флуоресцентного белка в части микроокружения хромофора, которое определяет его флуоресцентные свойства) что флуоресцентный сигнал будет меняться в разы и даже в десятки раз. И это огромное поле, которое только начинает развиваться, но первые (и совершенно фантастической красоты) успехи уже получены.
4
Нейробиологи всегда хотели иметь возможность следить за активностью клеток нервной системы, как они обмениваются сигналами, и кто из них в каком порядке возбуждается. И вот такие генетически кодируемые кальциевые сенсоры сегодня позволяют делать совершенные чудеса: вы можете в живой рыбке фактически видеть, как она думает, как у неё по нейронам бегает сигнал. Это просто видно, это непонятно, с этим надо дальше разбираться, но тот факт, что это видно, это уже совершенно потрясающая красота. Также нейробиологи использовали и многоцветное мечение. Они применили такую систему, как комбинаторное мечение, комбинаторика в цветовых вариантах флуоресцентных белков, то есть, в различных нейронах, во множестве нейронов, в каждом из них происходит индивидуальное событие или комбинация, которая случайным образом приводит к сборке, например двух генов красного флуоресцентного белка, одного зелёного, трёх синих. И вот таких комбинаций соотношения числа генов множество, они дают тысячи оттенков, глазами их, может быть, различить и сложно, но с помощью компьютерных методов это сделать можно, и прослеживать окончания нейронов, их хитросплетений, как они расползаются, кто с кем взаимодействует. Это, наверное, очень мощный инструмент для нейробиологов, но кроме того, это потрясающе красиво. Эта технология называется brainbow, это удивительные просто произведения искусства.
5
Флуоресцентный белок в конструкции с вашим белком-слияния может интересовать вас не только как статичный маркер, где расположен ваш белок, но вам может быть интересно посмотреть, с какой скоростью и куда он перемещается, это тоже можно делать. Можно обесцветить флуоресцентный белок мощным облучением в одной части клетки и посмотреть, с какой скоростью не обесцвеченный туда притечёт. А есть фотоактивируемые флуоресцентные белки. Это такие белки, которые могут свои характеристики менять в ответ на облучение; они могут превращаться, например, из не флуоресцентных в ярко-красно-флуоресцентные или из зелёных в красные, или из синих в зелёные. В частности, вы можете в одном участке клетки, «зажечь» флуоресцентный сигнал определённого цвета и посмотреть, с какой скоростью и куда он будет распространяться. Также вы можете отметить конкретные группы клеток и посмотреть, как они будут расползаться в ткани, которые вы исследуете.
6
Отдельное направление, тоже очень интересное и активно развивающееся, это мечение клеток в толще живых тканей. Можно осуществлять его с использованием разноцветных вариантов, но лучше всего осуществлять это через живые ткани, ввиду характеристик поглощения кожи, гемоглобина, лучше всего проницает то, что называется дальне-красное излучение, это длинноволновая часть видимого спектра, и ближний, инфракрасный диапазон, который мы глазом не видим. В природе флуоресцентных белков такого типа не существовало, зачем-то они не были нужны живым организмам, которые для каких-то своих внутренних нужд придумывали, эволюционировали в них эти флуоресцентные белки.
Множество групп работали над тем, чтобы получить как можно более дальне-красные флуоресцентные белки, но при этом, достаточно яркие и быстро созревающие, и низко токсичные, с тем, чтобы можно было метить живые ткани и в интактной мыши, на мышиной модели отрабатывать разные вещи, в первую очередь, в области онкологии. То, что называется перевиваемые опухоли, вы можете подсадить клетки, стабильно экспрессирующий дальне-красный флуоресцентный белок, и следить за тем, как эта опухоль развивается, отследить, как воздействуют те или иные терапевтические подходы. Есть в этой области и значительно более сложные модели, всё это уже работает вживую, и это используют как учёные, так и фармацевты в своей ежедневной работе.
Например, у вас есть два типа опухолевых клеток, а опухоль это редко один тип клеток, это, на самом деле, может быть сложное сочетание разных вариантов, у вас, зачастую, это комбинация нескольких типов, которые друг от друга зависят, и вы можете визуализировать один тип клеток красным флуоресцентным сигналом, другой — зелёным флуоресцентным сигналом, а ещё вы можете визуализировать взаимодействие, например, лиганда и рецептора, где они соприкасаются, потому что опять флуоресцентные белки могут быть использованы, и для этого есть так называемые варианты сплит-флуоресцентных белков. Вы берёте один ген, разделяете на две части, две половинки флуоресцентного белка, сами по себе не способные к флуоресценции — только там, где они встретят друг друга, они свернутся, созреет хромофор и появится флуоресцентное свойство, это тоже можно отслеживать. Дальше этот перечень можно продолжать практически бесконечно, множество и множество красивых технологий.
Есть технологии, которые позволяют пометить клетки в зависимости от того, на какой стадии деления они находятся, зелёным или красным флуоресцентным сигналом с использованием флуоресцентных белков, с мотивами, которые приводят к их быстрой деградации в разные фазы клеточного цикла. И на живом срезе ткани вы можете видеть, какие клетки у вас сейчас активно делятся, а какие не делятся. Это уже фантастической красоты и наглядности инструмент для того, чтобы исследовать разные процессы.
7
Ясно, что прогресс в этой области ещё возможен, хотя, есть и другие, альтернативные технологии, которые позволяют создать в том или ином виде генетически кодируемые варианты, приводящие к возникновению флуоресцентного сигнала. Ну и просто «палитра» хороших, ярких вариантов для многоцветного мечения ещё до конца не завершена, то есть, ещё на 5 — 10 лет есть работа для тех лабораторий, которые в этом направлении работают. И, тем не менее, можно сказать, что, пожалуй, основная, важнейшая часть была сделана за последние 10 лет. И Нобелевская премия, которая в 2008 году была вручена именно за открытие флуоресцентных белков и разработку на их основе вариантов, подвела, в значительной степени, некую черту под тем, что основа положена. Уже сегодня мы можем увидеть множество реально работающих инструментов, которые пошли в практику в исследованиях фундаментального характера, во множестве фармацевтических компаний, работающих в биомедицине над теми или иными клеточными технологиями, скринингом лекарственных препаратов. Другими словами открытие, разработка и переход в практику действительно состоялись, и сегодня уже можно брать и работать, и делать удивительные вещи.
